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作者單位：中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，中國科學院大學
出版期刊：Nature Reviews Molecular Cell Biology
當年IF：IF2019=55.470
Online時間：2020.9.24
DOI：10.1038/s41580-020-00288-9

摘要：源于原核生物的CRISPR-Cas基因組編輯技術對植物分子生物學的改變超出了人們的預期。CRISPR-Cas 具有穩(wěn)健性、高目標特異性和可編程性等特點，可對作物進行精準的遺傳操作，從而有機會創(chuàng)造出具有益性狀的種質，并開發(fā)出新型的、更可持續(xù)的農業(yè)系統(tǒng)。此外，基于CRISPR-Cas平臺的眾多新興生物技術也擴大了基礎研究和植物合成生物學的工具箱。在本綜述中，我們首先簡要介紹了CRISPR-Cas的基因編輯技術，重點是最新的精準基因編輯技術，如堿基編輯和質粒編輯。然后，我們將討論CRISPR-Cas在提高植物產量、質量、抗病性和抗除草劑性、育種和加速馴化方面的最重要應用。我們還重點介紹了CRISPR-Cas相關植物生物技術的最新突破，包括CRISPR-Cas試劑遞送、基因調控、多重基因編輯和誘變及定向進化技術。最后，我們討論了這一改變游戲規(guī)則的技術應用前景。

引言

全球農業(yè)生產正面臨前所未有的挑戰(zhàn)。到 2050 年，世界人口將達到 96 億，對主要作物的需求將增加 60%¹。由于綠色革命帶來的增產速度持續(xù)下降，而不利的氣候變化預計將進一步限制植物生產，因此需要培育出對不利環(huán)境有更強適應能力、能提高產量改善品質的栽培品種。然而，用于作物育種的傳統(tǒng)策略費力、費時、復雜，需要更有效、更省時的育種方法²。

隨著測序技術的飛速發(fā)展，越來越多的植物物種的基因組信息可供使用，基因組編輯系統(tǒng)提供了精準編輯基因的機會，為作物改良創(chuàng)造了新的機遇。基因組編輯的基本策略是使用序列特異性核酸酶在目標位點誘導 DNA 雙鏈斷裂（DSB）。此后，依賴于供體的同源定向修復（HDR）途徑或容易出錯的非同源末端連接途徑都會修復 DSB 并引入某種基因變化。早期的序列特異性核酸酶，包括巨核酸酶³、鋅指核酸酶⁴和轉錄激活劑樣效應核酸酶⁵，已被證明可有效用于植物基因組編輯，但它們的構建需要復雜的蛋白質工程，這限制了它們的適用性。

CRISPR（簇狀的、有規(guī)律間隔的、短回文重復序列）-Cas（CRISPR相關蛋白）是古生菌和細菌的一種適應性噬菌體免疫系統(tǒng)。由于CRISPR-Cas9和其他 CRISPR-Cas 系統(tǒng)依靠 DNA-RNA 識別和結合來進行序列特異性核酸切割，因此可以很容易地進行編程，以最低的成本在任何所需的靶位點引入DSB⁶。自 2013 年首次應用于植物^7-9以來，CRISPR-Cas 已被用于多種作物的基因組編輯，為其中許多物種引入了極具價值的農業(yè)性狀¹⁰。特別是新開發(fā)的精準CRISPR-Cas技術，由于能誘導精確的核苷酸變化，有望對農業(yè)產生重大影響。然而，CRISPR-Cas 的功能遠不止編輯特定基因座來改良作物。以這一改變游戲規(guī)則的多功能平臺為基礎，一些新型植物生物技術已經出現(xiàn)，它們能夠促進基因調控和蛋白質工程。這些技術已經對基礎生物學研究產生了影響，并帶來了廣泛應用的前景。

在本綜述中，我們首先介紹了基于CRISPR-Cas精準基因組編輯分子平臺。然后，我們討論了 CRISPR-Cas 在作物改良、農業(yè)育種和野生物種馴化方面的最新應用。我們還討論了幾種與CRISPR-Cas相關的植物生物技術，包括新型傳遞方法、基因表達調控、多重和高通量基因編輯以及原位定向進化。我們的目的是全面總結CRISPR-Cas技術在植物中的發(fā)展，并展望未來的應用前景。

Table 1. 植物中精準基因編輯技術的特征

ABE，腺嘌呤堿基編輯器；AFID，APOBEC-Cas9 融合誘導刪除系統(tǒng)；APOBEC3Bctd，APOBEC3B 的羧基末端催化結構域；CBE，胞嘧啶堿基編輯器堿基編輯器；CaMV，花椰菜花葉病毒；dCas9，無催化活性的 Cas9；ecTadA，大腸桿菌 tRNA 特異性腺苷脫氨酶；ecTadA*，大腸桿菌 tRNA 特異性腺苷脫氨酶變體；M-MLV，莫羅尼小鼠白血病病毒；NA，不可用；nCas9，Cas9 切分酶；STEME，飽和定向內源突變編輯器；UGI，UGI 編輯器。產品純度根據所需編輯產品的比例進行評估。

Figure 1. 脫氨酶介導和反轉錄酶介導的植物精準基因組編輯技術。

(a) 植物堿基編輯技術。堿基編輯器由 Cas9 nickase（nCas9；帶有D10A突變）與兩種蛋白質融合而成：脫氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（UGI）。胞嘧啶堿基編輯器（CBE）可生成胞嘧啶堿基編輯器（CBE）產生 C:G>T:A 堿基置換，而腺嘌呤堿基編輯器（ABE）產生 A:T>G:C 堿基置換。nCas9 與這兩種堿基編輯器的融合被稱為 "飽和定向內源突變編輯器"（STEME 編輯器"（STEME），利用單個引導 RNA（sgRNA）同時產生 C:G>T:A 和 A:T>G:C 雙堿基置換。

(b) APOBEC-Cas9 融合誘導刪除系統(tǒng)（AFID）。胞苷脫氨酶將胞苷轉化為尿苷，然后與胞苷脫氨酶-Cas9 復合物融合的尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）切除尿苷并生成一個嘧啶（AP）位點，該位點被單獨但共同表達的 AP 裂解酶切分。堿基切除修復后，Cas9 誘導的 DNA 雙鏈斷裂位點與脫氨基胞苷之間會產生精確的缺失。

(c) 質粒編輯技術。質粒編輯工具由 nCas9 與反轉錄酶和質粒編輯引導 RNA（pegRNA）融合而成。pegRNA 在反轉錄酶模板的 3′端攜帶所需的突變（綠色標記）。引物結合位點（PBS）與nicked DNA鏈結合，從而將模板反轉錄為所需的 DNA 序列。編輯后的核苷酸會以精確的方式插入目標位點。PAM，原間隔鄰接基序。

Figure 2. CRISPR-Cas9在育種技術中的應用

(a) 單倍體誘導。對MATRILINEAL（MTL）和DMP等基因進行CRISPR-Cas9編輯可產生單倍體誘導系，從而縮短穩(wěn)定遺傳背景所需的時間。

(b) 誘導有絲分裂以固定雜種活力。有絲分裂代替減數(shù)分裂（MiMe）基因型的植物可以通過在卵細胞中異位表達 BABY BOOM 1 (BBM1) 并引發(fā)孤雌生殖，或通過破壞MTL并導致父本基因組的消除，產生二倍體配子。

(c) 通過CRISPR-Cas在預定位點觸發(fā)同源定向修復或染色體易位，以鞏固有益的等位基因或打破不良的遺傳連接。HR，同源重組。

Box 1. 不使用外源 DNA 的植物基因組編輯

不使用外源 DNA 的植物基因組編輯優(yōu)于傳統(tǒng)的基因組編輯，因為它產生的脫靶突變較少，并減少了法定監(jiān)管問題。雖然基因組整合的外源序列可以通過雜交消除，但未檢測到的載體片段可能會殘留在基因組中，而且雜交對于無性繁殖的物種來說并不現(xiàn)實。一些使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白或 mRNA 的出色研究表明，基因編輯可以在水稻¹¹、萵苣¹¹和小麥^12-13中以無 DNA 的方式進行。然而，由于無 DNA 基因組編輯的效率低，且與引入外源選擇標記不兼容，因此阻礙了無 DNA 基因組編輯的推廣。解決這些問題的方法之一是創(chuàng)建內源可選擇標記。由于除草劑靶向基因（如乙酰乳酸合成酶（ALS）基因）中的某些氨基酸取代可賦予其對除草劑的耐受性，因此用單導 RNA 共同靶向感興趣的基因和 ALS，并選擇除草劑抗性，可極大地豐富具有所需編輯的感興趣基因的植物^14-15。如果每種成分都以 RNA 或蛋白質形式傳遞，這種可選擇的聯(lián)合編輯策略可促進無 DNA 編輯。促進無 DNA 基因編輯的另一種方法是使用形態(tài)發(fā)生調節(jié)劑（Box 2），通過與無 DNA CRISPR-Cas試劑一起傳遞來提高編輯效率，因為形態(tài)發(fā)生調節(jié)劑可以促進轉化體的再生^16-1⁷。隨著未來的發(fā)展，無DNA編輯可能會成為植物基因組編輯的主要方法。

Figure 3. CRISPR-Cas系統(tǒng)的遞送策略

(a) 將CRISPR-Cas試劑送入植物細胞。編碼 CRISPR-Cas 試劑（Cas 和單導 RNA（sgRNA））或 CRISPR-Cas-sgRNA 核糖核蛋白（RNP）的 DNA 或 RNA 可通過農桿菌、納米粒子和生物轟擊等方法送入植物細胞，這些方法都能穿過堅硬的細胞壁。聚乙二醇（PEG）可以介導植物原生質體的轉化?？蓪⒕幋a CRISPR-Cas 試劑的 DNA 或 RNA 導入植物病毒的基因組，病毒感染植物細胞，在細胞內復制，并通過質粒轉移到其他細胞。葉綠體靶向遞送可通過生物轟擊和納米粒子來實現(xiàn)。

(b) 通過從頭誘導分生組織進行基因編輯。首先移除 Cas9 基因表達植株的分生組織，然后將含有形態(tài)發(fā)生調節(jié)因子（MR）和 sgRNA 的農桿菌培養(yǎng)物注入修剪位點。形態(tài)發(fā)生調節(jié)劑可以誘導形成新的基因編輯分生組織，并從新生成的芽中收獲基因編輯植物。

(c) 利用植物 RNA 病毒誘導可遺傳的基因組編輯。將融合了 RNA 移動元件的 sgRNA 導入煙草鼠疫病毒（TRV）RNA2。經農桿菌介導滲入 Cas9 基因表達植物后，sgRNA 可通過移動元件在植物體內系統(tǒng)傳播，從而引入可遺傳的誘變。

(d) 通過單倍體誘導系傳遞 CRISPR-Cas。表達CRISPR-Cas的單倍體誘導系為具有轉化能力的植物授粉。受精后，進行基因編輯，消除父系基因組中攜帶MATRILINEAL（MTL）基因突變的基因，從而產生優(yōu)良的遺傳背景。通過染色體加倍可以產生同源突變株。

Box 2. 利用形態(tài)發(fā)生調節(jié)劑促進再生

再生是獲得CRISPR-Cas編輯植物的一個不可避免的核心步驟。然而，目前的再生系統(tǒng)主要依賴組織培養(yǎng)，費時費力，而且依賴物種和基因型。由于再生已成為在植物中應用CRISPR-Cas的障礙，形態(tài)發(fā)生調節(jié)劑已成為應對這一挑戰(zhàn)的有前途的工具。形態(tài)發(fā)生調節(jié)因子是一組轉錄因子，它們與植物激素一起在分生組織的決定和維持方面發(fā)揮作用并能誘導分生組織形態(tài)發(fā)生和產生胚狀結構。在玉米外植體中同時過表達編碼兩種形態(tài)發(fā)生調節(jié)因BABY BOOM 1 (BBM1)和WUS2的基因，可誘導近交系和不易轉化的組織再生出轉基因植株¹⁸。由于形態(tài)發(fā)生調節(jié)因子高度保守，這種方法很容易推廣到其他不可再生的基因型或作物上，如水稻、甘蔗和大豆¹⁵^{, 18-19}。利用形態(tài)發(fā)生調節(jié)因子，在將CRISPR-Cas和BBM1及WUS2一起送入植物細胞后，成功地再生出了經過基因編輯的難育玉米近交系植株²⁰。然而，由于BBM和WUS2的組成型表達可能導致發(fā)育異常和不育，因此亟需使用其他形態(tài)發(fā)生調節(jié)因子的新工具。

Figure 4. 多重基因組編輯策略

(a) 使用一種 Cas 蛋白和多個單導RNA（sgRNA）進行多重基因組編輯。兩個 sgRNA（靶向Cas9）或CRISPR RNA（crRNA；靶向 Cas12a）可同時用于靶向兩個（或多個）不同位點（T1和T2）。

(b) 多重正交基因組編輯策略使用催化不活躍的Cas9（dCas9）和不同的 sgRNA 支架（scRNA）。例如，scRNA1和scRNA2含有不同的RNA合體，可以招募不同的效應蛋白，如調節(jié)轉錄的蛋白或熒光蛋白。

(c) 一種多重正交基因組編輯策略，使用一種Cas蛋白和兩種sgRNA或crRNA，其中一種帶有全長的原核載體，另一種帶有截短的原核載體。全長 sgRNA-T1 或crRNA-T1 以基因1為目標，由相應的Cas蛋白進行刪除。截短的原空間介質（tsgRNA-T2或tcrRNA-T2）不支持Cas的全部催化活性，但能使Cas調節(jié)基因 2 的表達。

(d) 用Cas的同源物進行多重正交基因組編輯。使用正交sgRNA和/或crRNA 支架（未顯示）的Cas9和/或Cas12a的同源物可用于多重正交編輯。效應物可以是脫氨酶或基因表達調節(jié)劑。不過，在某些情況下可能不需要效應物，例如創(chuàng)建基因敲除。

(e) 由單一系統(tǒng)（SWISS）誘導的同步廣泛編輯。MS2的RNA aptamer 用于招募胞苷脫氨酶模塊，boxB用于招募腺苷脫氨酶模塊，成對的sgRNA 用于創(chuàng)建插入和缺失。boxB，招募 N22p 的 RNA aptamer 發(fā)夾；CBE，胞嘧啶堿基編輯器；ecTadA、ecTadA*，ecTadA變體；esgRNA，增強sgRNA；UGI，尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制劑；MCP，MS2 外殼蛋白；MS2，噬菌體 MS2的RNA aptamer；N22p，親和力增強的噬菌體-λ N肽。

Figure 5. 利用基于 CRISPR-Cas 的技術定向進化抗除草劑基因

(a) 基于CRISPR-Cas9技術的剪接因子3B亞基1（SF3B1）基因在黑麥草中的定向進化，以提高對剪接抑制劑herboxidiene的抗性。

(b) 利用飽和定向內源誘變編輯器（STEME）雙堿基編輯器對O. sativa乙酰輔酶A羧化酶2（ACC2）基因進行定向進化，提高水稻的抗除草劑性。PAM，原間隔鄰接基序；sgRNA，單導 RNA；WT，野生型。

結論與展望

CRISPR-Cas已成為改變植物基礎研究和應用研究游戲規(guī)則的工具。除了 CRISPR-Cas核酸酶誘導的indel突變外，人們還設計了一系列CRISPR-Cas衍生的編輯器，可以對基因組進行精確操作。這些工具具有無與倫比的基因編輯能力，幫助創(chuàng)造了數(shù)以百計的農作物品種，提高了農藝性能，并徹底改變了育種技術。

CRISPR-Cas為在短時間內馴化孤兒作物或野生物種以促進全球糧食安全和消除貧困帶來了可能性。與CRISPR-Cas相關的許多植物生物技術也得到了開發(fā)或更新，包括促進植物基因編輯的傳遞方法；在不同表達階段進行精準基因調控的方法；以及實現(xiàn)多位點基因組編輯、功能基因組學screening和植物定向進化的多重和高通量基因編輯方法。

然而，這些多功能工具還不能滿足植物基因組操作的所有需求，進一步開發(fā)對 CRISPR-Cas在植物中的應用至關重要。由于某些農業(yè)性狀是多個數(shù)量性狀位點的產物，編輯單個基因可能不會產生足夠的表型變化，因此開發(fā)高效的 CRISPR-Cas介導的定向插入和染色體組重排技術，以組合或"堆疊"突變等位基因將是非常有利的。由于破壞特定基因可能會帶來適應性損失，因此需要在調控基因表達和精準基因組編輯方面取得進一步進展，以高效、有針對性地微調基因功能。此外，由于將某些外源蛋白質直接轉化到植物中可能存在問題，因此完善CRISPR-Cas衍生的定向進化平臺，使其更適合植物系統(tǒng)將大有裨益。由于CRISPR-Cas試劑的遞送仍是植物基因組編輯的主要障礙，因此開發(fā)更多新型遞送方法是可取的；納米材料（如碳納米管^21-22、DNA納米結構²³和細胞穿膜肽²⁴）是以各種形式遞送CRISPR-Cas有前途的載體，因為它們可以在沒有機械輔助的情況下擴散到有壁的植物細胞中，且不會造成組織損傷。基礎基因研究也亟需取得進展，以確定與特定理想農藝性狀相關的基因。

除上述應用外，CRISPR-Cas 還可能被重新用于新的應用領域，如編輯線粒體和葉綠體的基因組、追蹤細胞系以闡明植物發(fā)育的基本模式、構建遺傳電路以整合和傳遞信號、開發(fā)植物生物傳感器以檢測內部和外部信號，以及植物合成生物學的其他應用。總之，CRISPR-Cas技術無疑已經并將繼續(xù)徹底改變農業(yè)和植物生物技術。

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文章來源：原本隨想

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