Abengoa生物能源新技術(shù)公司總部位于西班牙塞維利亞，是一家用創(chuàng)新解決方案進(jìn)行生物燃料生產(chǎn)的國(guó)際公司。該公司正在尋求建立一個(gè)篩選過(guò)程并使之自動(dòng)化，以確定產(chǎn)纖維素酶真菌突變菌株中的纖維素酶活性。
由于人工篩選過(guò)程成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，因此自動(dòng)化是此類大型項(xiàng)目的先決條件。Abengoa分別與 Biomar微生物技術(shù)公司和 Mejoran實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化公司建立了密切的合作關(guān)系，以打造理想的解決方案。Biomar位于西班牙萊昂，是微生物應(yīng)用研究的先驅(qū)，為醫(yī)療保健、農(nóng)業(yè)和可再生能源等領(lǐng)域提供可持續(xù)的解決方案，因此在微生物菌種的生成、篩選和生物活性分析方面擁有堅(jiān)實(shí)的背景。Mejoran公司總部位于西班牙馬德里，是一家實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化解決方案提供商。
篩選過(guò)程的第一步是選擇不同真菌突變體的克隆，并將其轉(zhuǎn)移到96孔板中，以產(chǎn)生微接種體，用于進(jìn)一步發(fā)酵。第二步是在96孔板中培養(yǎng)發(fā)酵不同的突變體。最后，對(duì)不同突變體產(chǎn)生纖維素酶的能力進(jìn)行評(píng)估。
事實(shí)證明，F(xiàn)reedom EVO 150工作站整合Pickolo克隆挑選模塊是進(jìn)行真菌克隆挑選和隨后不同培養(yǎng)條件篩選的理想解決方案。Freedom EVO工作站可以根據(jù)用戶的標(biāo)準(zhǔn)輕松識(shí)別、選擇和挑取真菌克隆。此外，F(xiàn)reedom EVOware®和Pickolo軟件還可以定義獨(dú)特的挑選程序，使微接種體的生長(zhǎng)率達(dá)到100%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體方法是從真菌克隆的周邊而不是從中心進(jìn)行挑選，這種掃動(dòng)挑選方式優(yōu)化了吸頭挑取的生物量，從而提高了生長(zhǎng)率。
Freedom EVO 150工作站（圖1）位于生物安全柜中，以確保無(wú)菌條件。它配備了一個(gè)使用一次性吸頭的八通道移液機(jī)械臂（LiHa）、一個(gè)移板機(jī)械臂（RoMa）、一臺(tái)Multidrop®Combi nL（Thermo Scientific）和一個(gè)Pickolo克隆挑選模塊，該模塊由Pickolo軟件、安裝在LiHa上的攝像頭和工作臺(tái)上的背光支架組成，用于克隆挑選。
圖1 帶Pickolo克隆挑選模塊的Freedom EVO工作站
Pickolo克隆挑選模塊硬件由安裝在LiHa（2）上的攝像頭（1）和工作臺(tái)上的背光支架（3）組成。培養(yǎng)皿由RoMa（4）搬運(yùn)。
將不同的產(chǎn)纖維素酶真菌突變體置于 90mm培養(yǎng)皿中，在37 °C、含添加劑的1%葡萄糖瓊脂（Gibco）上培養(yǎng)8至48小時(shí)。從培養(yǎng)皿中挑取克隆并轉(zhuǎn)移到96孔微孔板中，以獲得微接種體，用于進(jìn)一步的下游分析。圖2顯示了選擇、挑選和接種真菌克隆的自動(dòng)化工作流程概覽。
克隆挑選的標(biāo)準(zhǔn)在 Pickolo軟件中定義，該軟件集成在Freedom EVOware®上，可在Freedom EVO 平臺(tái)上執(zhí)行挑選流程。
真菌的外觀與傳統(tǒng)的細(xì)菌菌落大不相同，它們會(huì)發(fā)育成直徑大于1cm的深色菌落。本項(xiàng)目研究的菌株表現(xiàn)出典型的絲狀真菌菌絲生長(zhǎng)。因此，需要一個(gè)定制的挑選程序。
Pickolo軟件提供了大量不同的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定合適的挑選菌落。與其他挑克隆設(shè)備不同，該系統(tǒng)具有獨(dú)特的功能，可以從較大菌落的周邊而不是從中心進(jìn)行掃動(dòng)式挑取。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)榫渲行耐ǔＳ砷_(kāi)始?jí)乃赖睦霞?xì)胞組成。新細(xì)胞位于菌落外圍，挑取后更有可能存活。圖3顯示了從真菌菌落邊緣挑取克隆的過(guò)程。
圖3 使用Pickolo軟件拍攝的照片顯示了木質(zhì)素分解真菌克隆，在克隆挑選步驟后留下的劃痕（紅色箭頭）。
收集足夠的真菌生物量，
確保100%的轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)率，以便進(jìn)行后續(xù)分析
產(chǎn)纖維素酶的真菌菌株是真菌細(xì)胞的部分菌絲長(zhǎng)入瓊脂2-3mm的微生物。為了制備進(jìn)一步分析的材料，必須收集瓊脂內(nèi)部和表面的所有生物材料，以獲得足夠的、可存活的接種體，用于所選菌落的進(jìn)一步生長(zhǎng)和擴(kuò)增。
我們?cè)贔reedom EVO工作站上開(kāi)發(fā)了一種定制方法，將吸頭插入瓊脂的動(dòng)作與側(cè)向移動(dòng)的動(dòng)作相結(jié)合，模仿人工挑選克隆的典型掃動(dòng)動(dòng)作，同時(shí)吸出生物質(zhì)。使用針或針頭的克隆挑選設(shè)備無(wú)法實(shí)現(xiàn)這種完全吸取生物材料的操作。下圖4展示了這一過(guò)程。
圖4 從瓊脂膠中提取真菌克隆的獨(dú)特程序圖解
使用這種方法可獲得直徑為60-100μm的微接種體，生長(zhǎng)率為100%。所有挑取的克隆都在96孔微孔板中培養(yǎng)成微接種體（圖5），這種培養(yǎng)方式非常適合進(jìn)一步的下游測(cè)試。由于挑取的所有克隆都能存活，這種方法的產(chǎn)量也比人工方法高。
圖5 96孔板培養(yǎng)48小時(shí)后微接種體的生長(zhǎng)情況
這個(gè)宏大的纖維素酶生產(chǎn)真菌高通量克隆篩選 (HTS) 項(xiàng)目展示了 Freedom EVO克隆挑選工作站的高容量和獨(dú)特功能。與典型的細(xì)菌菌落相比，真菌的挑選更為復(fù)雜，需要先進(jìn)的選擇標(biāo)準(zhǔn)、復(fù)雜的移液和模擬人工挑選過(guò)程的吸頭移動(dòng)相結(jié)合。
利用這些特點(diǎn)，可以識(shí)別和挑選大型真菌克隆。成功地從菌落一側(cè)挑取足夠多的可存活生物材料后，就能為后續(xù)研究創(chuàng)造出具有100%生長(zhǎng)率的微接種體。
這里展示的自動(dòng)化解決方案為Abengoa提供了在預(yù)期時(shí)間內(nèi)執(zhí)行其宏大的HTS計(jì)劃所需的可重復(fù)性和有效性。
數(shù)據(jù)由Abengoa生物能源公司、Biomar微生物技術(shù)公司的Angeles Vinuesa和Mejoran實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化公司的Francisco Arenal慷慨提供。
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