亚洲精品国产无码成人av_国产大学生酒店激情视频_99reAV国产精品无码_亚洲一级av无码毛片精品色欲_国产成人精品三上悠亚

迄今為止，多項研究已經(jīng)證實了mNGS在臨床和公共衛(wèi)生中的應用前景。2013年C.Y.Chiu教授團隊首次成功應用mNGS技術在一位不明原因發(fā)熱的男孩樣本中鑒定出鉤端螺旋體[4]，準確的病原學診斷帶來了精準的抗菌藥物治療，最終使患者順利康復。2019年Blauwkamp等人探究了mNGS用于膿毒癥患者的檢測，血培養(yǎng)鑒定出18.1%的微生物，而mNGS能檢出48.6%，且保持了92.9%的敏感性和62.7%的特異性[5]，與血培養(yǎng)的一致性達到了93.6%。急性傳染病精準診斷（PDAID）研究招募了204名特發(fā)性腦膜炎、腦炎或脊髓炎患者，發(fā)現(xiàn)mNGS與傳統(tǒng)檢測方法的陰性一致率為98%，并且mNGS將疾病的診斷率提升了22%[6]。一項針對不明原因發(fā)熱兒童的病因學研究證實，通過mNGS明確病因可避免不必要的抗菌藥物的使用[7]。綜上所述，目前mNGS在呼吸道感染、骨和關節(jié)感染、復雜和非典型感染及免疫抑制等特殊人群中被廣泛應用[3]，為不明原因發(fā)熱、反復感染、神經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染及眼部感染患者的病原學鑒定提供了解決方案[8, 9]，也可作為急危重癥感染患者、罕見病原感染患者的病原篩查技術[10]。

1. mNGS技術在臨床病原微生物檢測中的價值：無需預設、可覆蓋廣泛的病原微生物助力新發(fā)、罕見、難檢病原的鑒定。

（1）傳統(tǒng)檢測方法只能檢測已知病原，檢測通量有限，對于臨床醫(yī)生的經(jīng)驗依賴性大，這使得新發(fā)/罕見病原體感染的診斷成為了挑戰(zhàn)。mNGS通過對樣本中所有核酸進行測序，從而實現(xiàn)廣泛無偏的病原微生物檢測。這為臨床上不明原因的感染、罕見致病菌病原鑒定提供了可能。例如，2019年12月，我國湖北省武漢市出現(xiàn)了嚴重的不明原因肺炎。僅耗時3個月通過mNGS確定了新型的冠狀病毒（SARS-CoV-2）是引起肺炎的原因[11]。鸚鵡熱衣原體感染的患者會出現(xiàn)不同程度的肺炎，但是傳統(tǒng)方法檢測鸚鵡熱衣原體不僅耗時長且敏感性低，對此類病原的感染診斷較為困難。Gu等人近期報道了5例通過mNGS方法診斷了鸚鵡熱衣原體肺炎，使得患者很快從針對性抗菌藥物治療中獲益[12]。除病毒之外，仍有部分病原體難以培養(yǎng)或需要較長培養(yǎng)時間，是傳統(tǒng)方法下的難檢病原。mNGS作為一種不依賴于培養(yǎng)的檢測方法，可以在更短的時間內實現(xiàn)對這些難檢病原的檢測。苗等人在561名急性或慢性感染患者隊列中評估了mNGS的臨床實踐表現(xiàn)，研究證實mNGS的敏感性為50.7%，特異性為85.7%。并且，mNGS檢出苛養(yǎng)菌的能力優(yōu)于培養(yǎng)，尤其是對于結核分枝桿菌、病毒、厭氧菌和真菌[13]。一項評估m(xù)NGS檢測結核分枝桿菌可行性的研究表明，mNGS只需要3天就可以識別出67.23%（80/119）的感染病例，而傳統(tǒng)方法只能檢測到49.58%（59/119）的感染病例，并且部分需要90多天的培養(yǎng)。在快速檢測同時mNGS與Xpert和傳統(tǒng)培養(yǎng)表現(xiàn)出檢測結核分枝桿菌相似的敏感性（47.92% vs 45.83%，46.81%）[14]。

（2）mNGS檢測經(jīng)抗菌藥物治療患者，混合感染患者具有優(yōu)勢：經(jīng)驗性使用抗菌藥物在急性重癥感染患者的治療中仍比較普遍，但是帶來的問題是可能會影響傳統(tǒng)方法（例如培養(yǎng)）鑒定病原體的敏感性[15]。由于mNGS技術并不依賴于活菌，而是基于微生物核酸的檢測，因此受先前抗菌藥物治療暴露的影響相對較小。苗等人通過對561名急性或慢性感染患者的隊列研究發(fā)現(xiàn)，在接受過抗菌藥物治療的患者中mNGS的檢出敏感性顯著高于培養(yǎng)（52.7% vs 34.4%），而接受和未接受過抗菌藥物治療的患者mNGS檢出結果相近[13]。一項mNGS用于疑似中樞神經(jīng)感染病原檢測的研究表明，抗菌藥物治療后，mNGS依舊可以檢出部分病原體，mNGS在經(jīng)過抗菌藥物治療患者的敏感性為66.67%，相對于未經(jīng)抗菌藥物治療患者的90%的敏感性稍低[16]。免疫功能低下人群的感染通常更加復雜，感染的后果也更加嚴重。免疫功能低下的患者更容易出現(xiàn)混合感染，有研究證實mNGS在混合感染診斷方面有明顯優(yōu)勢。一項回顧性研究基于55名肺部混合感染的患者評估了mNGS的檢測性能，研究發(fā)現(xiàn)mNGS診斷混合感染的敏感度高于常規(guī)檢測（97.2% vs 13.9%），但特異性低于常規(guī)檢測（63.2% vs 94.7%）[17]。

2. mNGS廣泛應用于病原檢測的局限：mNGS用于臨床微生物檢測具有獨特優(yōu)勢，在臨床應用已比較普及，但其檢測某些苛養(yǎng)/難檢/低載量微生物能力還需要提升，寬譜的微生物覆蓋導致mNGS結果解讀也存在著巨大的挑戰(zhàn)。

（1）mNGS檢測某些苛養(yǎng)/難檢/低載量微生物能力還需要提升：mNGS通過對樣本中所有核酸進行測序，從而實現(xiàn)廣泛無偏的病原微生物檢測。微生物序列數(shù)（reads）是支撐病原微生物被正確鑒定的關鍵，序列數(shù)是指檢測到的短DNA序列的數(shù)目，某個特定病原體的序列數(shù)與樣本中該微生物的數(shù)量正相關，但同時也受測序數(shù)據(jù)量、病原基因組大小、病原基因組特異性序列比例，病原核酸提取難度以及人類宿主核酸占比等影響。由于人類基因組遠大于微生物基因組，樣本中宿主細胞數(shù)通常也遠高于微生物細胞，因此，宿主核酸占比是影響mNGS病原微生物正確鑒定的最重要因素。宿主的核酸占比在不同樣本中有差異，不同樣本間宿主核酸占比在80%-99%[8, 18]。去除宿主核酸是目前正在探索的、提升mNGS檢測能力的一種技術方案。目前有多種去除/降低樣本中宿主核酸的方法在研，包括離心或過濾等物理方法[19, 20]、化學試劑的差異裂解等化學法[21]以及基于CRISPR-Cas9方法的選擇性雜交去除法等[22]。但是這些方法都會在一定程度上損失部分病原體[23]。此外，去宿主過程中使用額外的試劑，可能增加外源性背景污染的風險[2]。不同樣本的宿主細胞占比的復雜性也增加了去宿主核酸的難度。對于宿主核酸的去除方法，目前還沒有比較有效可行的方法和標準。

除去宿主核酸占比這個因素，病原自身特征如：基因組小或低載量高致病性的微生物也是影響檢測性能的重要因素。一項基于mNGS檢測病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，基于mNGS方法檢測到的10種病毒的支持reads大部分在10條以下，病毒平均的基因組覆蓋度約2%[24]。在如此低的基因組覆蓋度下，支持reads數(shù)變得十分重要。但是有些病毒的載量有限，一項研究兒童腦炎星狀病毒的研究，在mNGS測序數(shù)據(jù)量達到134M時，僅檢測到1600條（0.0012%）星狀病毒的reads[18]。另外，如人類免疫缺陷病毒、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒等RNA病毒同樣也存在載量的問題。由于某些逆轉錄病毒與人類轉錄元件的相似性，當檢出reads較少時，無法很好地進行二者的區(qū)分導致無法準確報出[25]。

此外，一些具有較厚細胞壁的病原體如真菌和胞內菌，可能會因為較低的核酸提取效率從而導致檢測輸入的微生物核酸載量降低，影響檢測性能[18]?；诖?，目前mNGS在真菌檢測的應用上還存在一些爭議。王等人通過mNGS分析了21例真菌性肺炎患者，mNGS檢出19例，但研究發(fā)現(xiàn)mNGS在檢測隱球菌上并未表現(xiàn)出優(yōu)勢[26]。方等人的另一項研究中也提出mNGS在檢測真菌方面與傳統(tǒng)方法各有優(yōu)劣，傳統(tǒng)檢測方法對白色念珠菌和熱帶念珠菌的檢出性能較好，而mNGS對曲霉菌的檢出性能較好[27]。另外一項mNGS用于腦膜炎患者的檢測研究中，雖然mNGS和傳統(tǒng)檢測表現(xiàn)出較高的一致性，但仍存在漏檢患者。漏檢患者的mNGS中有牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、新型隱球菌等微生物檢出，但是豐度未達到預先確定的報告閾值[28]。為了不漏檢一些致病性微生物，如結核分枝桿菌、軍團菌，一般這些微生物都特殊設置了較低的報出閾值[24, 25]。但是，如此低的閾值下，也會使得臨床判斷和決策變得困難[10]。

（2）寬譜的微生物覆蓋導致mNGS結果解讀是一項巨大的挑戰(zhàn)：mNGS理論上可以檢測所有目前已知的約8000余種甚至目前未知基因組序列的病原體。因而，mNGS檢測結果中，環(huán)境、試劑、容器中的微生物污染，以及在人體內定植等大量非病原微生物和致病微生物的檢測信號混合在一起[29]。這要求在mNGS生信分析過程中不僅要構建包含所有病原微生物的數(shù)據(jù)庫，還需要構建相關的數(shù)據(jù)庫用于過濾[30]?？紤]到不同微生物的致病性和致病條件，mNGS需要設定個性化的報出閾值[3]。如結核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌及流行性出血熱病毒等高致病但低病原載量的病原體專家共識建議，在排除污染的前提下，即使檢出1條序列也應視為陽性[13, 31-33]。即便如此，mNGS報出的微生物數(shù)量也在5-20個，這使得mNGS的臨床解讀具有巨大的挑戰(zhàn)，需要大量的臨床、病原微生物診斷和專業(yè)經(jīng)驗[3]，需要考慮臨床整體情況[5]，這通常需要一個專業(yè)的多學科團隊來完成[34]。

tNGS技術是基于NGS的靶向富集（Target enrichment）的測序技術。在病原檢測上，通過超多重PCR擴增或雜交捕獲技術富集待測樣本中幾十種至幾百種已知病原微生物（特別是低濃度的病原微生物）及其毒力和/或耐藥基因，進而進行基于NGS的高通量多病原平行檢測。靶向富集是tNGS技術的關鍵環(huán)節(jié)，通過對目標基因組區(qū)域（regions of interest，ROI）進行富集[35]，確保ROI區(qū)域有足夠的測序深度和覆蓋度，進而成功地識別目標病原體。相對于mNGS技術，tNGS可將微生物核酸進行幾十乃至上萬倍的富集。目前國內外tNGS技術的靶向富集策略主要分為兩種：基于超多重PCR擴增的tNGS和基于雜交捕獲的tNGS[35]。tNGS技術在疾病檢測領域特別是腫瘤基因檢測領域已廣為流行，但在病原微生物檢測中的應用尚處于起步階段，且相關研究文獻較少，本部分主要闡述tNGS靶向富集策略、技術優(yōu)勢、技術難點等方面。

1. tNGS靶向富集策略：tNGS的兩種主要靶向富集方法中，雜交捕獲靶向測序主要是利用探針雜交富集目標片段，適用于基因組目標區(qū)域的全面檢測。目前應用的主要是液相雜交捕獲測序，即基于堿基互補配對原理，設計合成核酸探針，對DNA文庫進行基于液相環(huán)境的目標區(qū)域雜交富集，并進行測序。對于雜交捕獲測序，會涉及到探針序列設計、目標病原體的選擇、精細化數(shù)據(jù)庫的構建等多個技術開發(fā)難點。在探針設計時，需要評估覆蓋位置的序列特征，如果探針有很多落在重復序列區(qū)，或者高拷貝序列區(qū)，則探針會結合較多的非目標區(qū)域。設計更加特異性的探針則可以有效減少非特異序列的結合，提升捕獲特異性。另外，病原基因組探針的覆蓋度，能否均勻識別病原基因組區(qū)段；探針能否準確識別/區(qū)分近緣物種，特異性序列marker覆蓋度如何；在同一病原不同亞型（株系）間，多種參考基因組如何選擇等眾多問題均需綜合考量。

超多重PCR靶向測序即針對感興趣的目標區(qū)域，設計多重PCR引物進行擴增富集并進行測序的技術。通常適用于檢測幾十到幾千個位點，或幾十kb以下的區(qū)域。其核心是引物設計，先通過PCR擴展富集目標片段，再進行文庫構建，適用于研究的目標區(qū)域相對較小，對于拷貝數(shù)較低的模板DNA，可產生足夠數(shù)量用于測序的擴增子，這種方法能明顯提高效率，節(jié)約時間，降低經(jīng)濟成本，難點在于多對引物間存在互相干擾和非特異性擴增等問題。也有研究表明，基于雜交捕獲的tNGS技術比基于擴增子的方法具有更好的均一性，偏好性弱，可能會更客觀的反應樣本中病原的真實含量[26]，但技術開發(fā)比超多重PCR擴增方法難度更大且檢測流程更復雜。兩種方法之間的主要差異見表1。

表1.雜交捕獲靶向測序和超多重PCR靶向測序的富集方法主要差異比較

（1）富集增加目標微生物檢測覆蓋，提升檢測可信度：tNGS技術通過靶向富集目標病原體核酸序列，可以特異性增加測序數(shù)據(jù)中目標病原體序列的數(shù)量和比例，提高對目標微生物檢測的reads數(shù)和覆蓋度[2]。tNGS的靶向富集，即使在不去除宿主的條件下，也可以特異性增加微生物核酸的比例。一項研究比較了去除宿主核酸和病毒靶向捕獲增強兩種方法對mNGS檢測病毒能力的提升，研究發(fā)現(xiàn)通過靶向捕獲可以增加90%的病毒核酸的載量，但是去除宿主核酸方法的效果波動較大[38]。趙等人的一項研究中，比較了基于核糖體RNA富集的tNGS與mNGS，研究中發(fā)現(xiàn)在樣本中微生物核酸的占比提高了7倍，無論是病毒還是真菌或耐藥基因，tNGS的檢出結果與臨床一致性高[25]。tNGS在富集后，能提升苛養(yǎng)和低載量病原的載量和覆蓋度，提升檢測可信度。Todd等人比較了基于mNGS和針對病毒捕獲的tNGS在檢測病毒上的差異。研究發(fā)現(xiàn)，不明原因發(fā)熱的患兒樣本中，捕獲后檢出病毒的reads數(shù)增加了674倍，病毒基因組的覆蓋度從2.1%提升到了83.2%，得益于覆蓋度的提升，捕獲的tNGS可以用于分析基因組變異度高達58%的指環(huán)病毒[24]。另一項在肺部感染的患者中比較tNGS和mNGS的檢測結果的研究中，tNGS中檢出更多的結核桿菌混合感染，比mNGS中多了一倍[37]。綜上所述，針對靶向范圍內微生物，tNGS的靶向富集能提升微生物對應的序列數(shù)，有助于微生物可信檢出。

（2）tNGS可穩(wěn)定的進行耐藥或毒力基因的檢測：測序技術的發(fā)展使人們對微生物菌株基因型、毒力、耐藥基因和系統(tǒng)遺傳背景有了較深入的了解。Mason等通過全基因組測序分析了1379個金黃色葡萄球菌分離株的耐藥基因數(shù)據(jù)。并發(fā)現(xiàn)耐藥基因型與表型之間的相關性可高達98.3%[39]。對于耐藥基因檢測方面，以mecA、KPC等基因為代表性的耐藥，通常只需要鑒別病原感染樣本中是否存在耐藥型別，但難點在于如何將耐藥基因與致病病原相結合，考慮到耐藥基因的復雜性，結合致病菌解讀耐藥和毒力基因是有必要的；另一方面，以結核菌的耐藥為代表性的基因改變，需要精確到突變位點[40]。《宏基因組測序病原微生物檢測生物信息學分析規(guī)范化管理專家共識》中指出，mNGS因其得到的微生物測序序列數(shù)不足樣本總序列的5%，特異性序列覆蓋度不到微生物基因組1%，在這種情況下進行耐藥基因、毒力島基因、轉錄組及代謝通路分析幾乎不可能[32]。因此，mNGS技術對耐藥和毒力基因檢測存在局限性[2]。

tNGS技術可以針對耐藥/毒力基因進行目標區(qū)域富集，確保準確穩(wěn)定的檢出。在一項基于201個呼吸道樣本的tNGS用于病原微生物和耐藥基因檢測分析的探究研究中發(fā)現(xiàn)，tNGS報出的53.8%的耐藥相關基因與臨床藥敏檢測一致[36]。但需要考慮同一耐藥基因在不同微生物產生的耐藥效果不同。在上述研究中，研究發(fā)現(xiàn)多個攜帶與產碳青霉烯酶相關的OXA耐藥基因的銅綠假單胞菌，但是臨床藥敏分析中并未發(fā)現(xiàn)這些微生物的耐藥表型[36]。因此在靶向目標耐藥/毒力基因時，需考慮同一基因的不同突變類型，產生的耐藥效果不同，實現(xiàn)耐藥/毒力基因的全覆蓋。

（3）tNGS檢測因目標病原體設定范圍明確，可以顯著簡化解讀流程：在mNGS和tNGS的對比研究中發(fā)現(xiàn)，基于mNGS檢測樣本單次報出的病原數(shù)量在4-24個，而tNGS報出集中在1-2個[36]。在病原微生物數(shù)據(jù)庫構建方面，相較于mNGS數(shù)據(jù)庫的幾萬種微生物的“大而全”，tNGS數(shù)據(jù)庫可更加聚焦幾十至幾百種目標病原體，更加深入細致地區(qū)分不同亞種和亞型。研究表明，生信自動分析階段，mNGS中96.8%的檢測結果被判讀為背景微生物，而在tNGS中這項比例為75.2%[36]。即便如此，tNGS數(shù)據(jù)庫的精細設計也是復雜且有必要的。數(shù)據(jù)庫的精細設計可以保證靶向檢測范圍內病原微生物的準確篩查，尤其是對于罕見和苛養(yǎng)微生物的覆蓋度，同時對于常見致病菌還要精細到種水平的鑒別上。在tNGS和mNGS的對比研究中，兩種方法都檢測到了卡氏肺孢子菌（P. carinii），但是考慮到它并非人類致病微生物均未報告。但是在tNGS中檢出的新型隱球菌被錯誤的識別為格特隱球菌[36]。這表明tNGS生信數(shù)據(jù)庫的精細化、專業(yè)化的設計在病原識別中是至關重要的。

3. tNGS臨床應用的不足：tNGS的檢測panel是依據(jù)已知病原設計的，因此tNGS不適用于新發(fā)病原的檢測。盡管理論上panel可以納入了幾十乃至幾百種病原體，但可能仍需要結合臨床實際應用場景進行針對性的panel設計，如果感染病原體本身不在Panel的設計范圍內，則無法檢出。近期tNGS和mNGS的比較研究中報道，mNGS中檢出大量的人類皰疹病毒，但tNGS的病原檢測范圍并未包含該病毒故tNGS中并未報道；除此之外，mNGS還在tNGS的檢測范圍外檢出了8種細菌，2種寄生蟲，5種病毒和5種真菌[37]。

mNGS技術通過對臨床標本進行宏基因組測序，可以無偏向性地檢出標本中的多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲），越來越多的臨床研究及特殊病原體感染案例報道肯定了mNGS在感染性疾病輔助診斷中的價值。目前，mNGS主要應用于懷疑感染的急危重癥、常規(guī)檢測陰性但懷疑感染等疑難重癥的患者。考慮到價格和解讀難度等問題，mNGS暫時不適合應用于常規(guī)感染的初步篩查。tNGS針對臨床初篩需求設計panel，覆蓋常見病原體；同時通過靶向擴增針對性提升病原體的檢出可信度。該技術有望填補傳統(tǒng)分子檢測和mNGS之間的需求空白。因此，tNGS在臨床檢驗領域正受到越來越多的關注。

當然，隨著NGS技術在感染性疾病精準診療上的應用，對于mNGS和tNGS檢測的技術優(yōu)化和應用規(guī)范化的推進是必要的。在技術層面，自動化流程以及準確且更快速的測序儀可能是mNGS和tNGS技術轉化的兩大發(fā)力點；在應用層面，mNGS和tNGS都需要進一步明確臨床使用場景，并根據(jù)臨床應用場景明確檢測樣本類型，目標病原范圍，陽性判斷值，以及產品配套使用的數(shù)據(jù)庫。未來基于傳統(tǒng)檢測、tNGS和mNGS的小、中、大覆蓋范圍的病原檢測方法將更有效、更精準的服務于臨床的精準診療。

(文章來源：mp.weixin.qq.com/s/XUFoHNIvtE4z9bdUuL0JAw)