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蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容主要是解析基因組全部的蛋白質(zhì)組，并通過(guò)蛋白定量和定性上變化反映細(xì)胞、器官和有機(jī)體的生理變化；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后修飾使得組成蛋白的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于組成基因的數(shù)量。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)迅速發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)逐漸成為了蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主流技術(shù)。

近期蛋白組學(xué)領(lǐng)軍人物Matthias Mann團(tuán)隊(duì)在《Molecular & Cellular Proteomics》特約專欄發(fā)表了題為“MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning”【1】的最新綜述，總結(jié)了不斷成熟的樣本前處理、蛋白檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析方法，展望了基于質(zhì)譜的體液蛋白質(zhì)組學(xué)走向臨床應(yīng)用的廣闊前景。

a) 擴(kuò)展性、穩(wěn)健性和重復(fù)性：
在體液蛋白質(zhì)組學(xué)中，考慮到不斷增長(zhǎng)的研究隊(duì)列，在可管理的時(shí)間框架內(nèi)確保一致、無(wú)污染和可靠的樣品制備質(zhì)量尤為重要。事實(shí)上，體液的應(yīng)用總體上推動(dòng)了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)的品質(zhì)追求。如今，全自動(dòng)或半自動(dòng)化的液體處理機(jī)器人已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，樣品制備過(guò)程也得到了簡(jiǎn)化和精簡(jiǎn)。

b) 高豐度蛋白挑戰(zhàn)：

在血漿或血清中，以及在較小程度上在其他體液中，少數(shù)高度豐富的蛋白質(zhì)占了定量肽強(qiáng)度的絕大部分，極大地?fù)p害了較少豐富的蛋白質(zhì)的檢測(cè)【2】。面對(duì)高豐度蛋白的挑戰(zhàn)，除了常規(guī)的去除高豐度蛋白排除其信號(hào)干擾以達(dá)到檢測(cè)低豐度蛋白的目的，還有通過(guò)具有特定表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的納米顆粒也被用來(lái)選擇性地富集低豐度的蛋白質(zhì)。例如Seer平臺(tái)基于磁珠富集的ProteoMiner蛋白富集試劑盒，當(dāng)樣本分成多組分進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以達(dá)到數(shù)千個(gè)血漿蛋白的鑒定深度【3】。

體液蛋白質(zhì)組學(xué)的最新工作流程改進(jìn)

二、蛋白檢測(cè)

a) DIA:

近年來(lái)，質(zhì)譜儀和采集方案共同發(fā)展，數(shù)據(jù)獨(dú)立采集(DIA) 質(zhì)譜的成熟和廣泛采用標(biāo)志著一個(gè)重要的里程碑。這一進(jìn)展主要是由新算法和高性能質(zhì)譜儀的發(fā)展推動(dòng)的。DIA固有的定期采樣所有前體的能力使得肽片段離子的采樣更加均勻，從而提高了數(shù)據(jù)的完整性，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)組的深度，并提高了靈敏度。

b) 多路參考信道:

非等壓多路DIA (mDIA)是最近的一項(xiàng)發(fā)展，有望將DIA的優(yōu)點(diǎn)與多路復(fù)用的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)。這里用二甲基試劑創(chuàng)建了MS1可識(shí)別的通道，允許將樣品匯集起來(lái)進(jìn)行測(cè)量，并添加參考蛋白質(zhì)組。通道因其特有的質(zhì)量位移而相互聯(lián)系。在每個(gè)質(zhì)譜測(cè)量中，參考蛋白質(zhì)組的鑒定延續(xù)到樣品通道，消除了對(duì)其鑒定的需要。此外，參考通道可以實(shí)時(shí)監(jiān)控分析性能。由于在所有樣本中都是相同的，因此它可以作為研究樣本之間甚至研究和實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行定量比較的橋梁。不同的參考蛋白質(zhì)組也可以相互“翻譯”或通過(guò)一起測(cè)量來(lái)“協(xié)調(diào)”。對(duì)于絕對(duì)定量，參考蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)子集可以與絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)。

c) 親和結(jié)合物:

在過(guò)去的幾年中，親和結(jié)合劑技術(shù)已被廣泛用于測(cè)量大型臨床血漿或血清隊(duì)列——主要是Olink的基于抗體的鄰近延伸測(cè)定(PEA)或SomaLogic的基于DNA適配體的SOMAscan測(cè)定【4】。許多質(zhì)譜研究都是小型的和專門(mén)的，而親和結(jié)合劑研究是相當(dāng)昂貴的，但仍然被用于大型隊(duì)列。

d) 生物標(biāo)志物panel

多種生物標(biāo)志物的組合被稱為“體外診斷多變量指數(shù)測(cè)定”。無(wú)偏好性的蛋白質(zhì)組學(xué)通常會(huì)產(chǎn)生一組生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物單獨(dú)具有較小的折疊變化，但結(jié)合起來(lái)可以在體液蛋白質(zhì)組學(xué)中捕獲足夠的信息，以解決混雜因素并準(zhǔn)確診斷疾病狀態(tài)。體液蛋白質(zhì)組是多維的，受遺傳學(xué)、性別、年齡、生活方式、既往疾病或治療等因素的影響，生物標(biāo)志物panel本質(zhì)上更適合解決這種復(fù)雜性。

多路參考通道

三、數(shù)據(jù)分析方法

a) 大隊(duì)列協(xié)同與矩形策略：

矩形策略利用大隊(duì)列來(lái)更好地發(fā)現(xiàn)真正的生物標(biāo)志物。檢測(cè)區(qū)分病理病例和對(duì)照組的生物標(biāo)志物面臨著由混雜因素引入的變異性或偏差帶來(lái)的挑戰(zhàn)。在小隊(duì)列中，病例和對(duì)照組之間的明顯蛋白質(zhì)組差異可能由隨機(jī)混雜變異性主導(dǎo)。在大型隊(duì)列中，這種隨機(jī)性被大量稀釋，導(dǎo)致感興趣的真實(shí)效應(yīng)和生物標(biāo)志物候選物占主導(dǎo)地位，在進(jìn)一步的獨(dú)立隊(duì)列中具有更好的驗(yàn)證前景。

大隊(duì)列協(xié)同與矩形策略

b) 研究模擬現(xiàn)實(shí)的集體和分析：

研究集體需要與所研究的疾病和預(yù)期應(yīng)用相匹配。例如，有些疾病是作為一系列或連續(xù)的表型出現(xiàn)的，或逐漸表現(xiàn)出來(lái)的，而對(duì)照者可能有不同程度的患病風(fēng)險(xiǎn)，甚至受某種疾病的影響。這可能需要縱向隊(duì)列或比較多個(gè)條件，而不是依賴于病例和對(duì)照的二元分類。此外，復(fù)雜的場(chǎng)景可能只能通過(guò)大規(guī)模研究集體支持的基于人群的理解來(lái)解決。大的隊(duì)列可以研究具有挑戰(zhàn)性的場(chǎng)景。這些包括小效應(yīng)量、用于鑒別診斷或結(jié)果分析的多種條件的比較、縱向變化、用于篩選應(yīng)用的非常高的測(cè)試準(zhǔn)確性的驗(yàn)證，或在群體水平上理解表型。

大隊(duì)列可研究場(chǎng)景

四、未來(lái)展望

體液蛋白質(zhì)組學(xué)的許多挑戰(zhàn)現(xiàn)在已經(jīng)被克服，許多研究已經(jīng)在獨(dú)立的隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。生物標(biāo)志物雖仍集中在高豐度范圍內(nèi)，但也表明隨著技術(shù)的進(jìn)步正在將可檢測(cè)的體液蛋白質(zhì)組的邊界推向較低豐度范圍，還有更多的生物標(biāo)志物等待發(fā)現(xiàn)。曾經(jīng)的挑戰(zhàn)已變?yōu)樨?cái)富，基于質(zhì)譜的體液蛋白質(zhì)組學(xué)已做好準(zhǔn)備走向未來(lái)。

參考文獻(xiàn)：

【1】Jakob M. Bader, Vincent Albrecht, Matthias Mann,MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning,Molecular & Cellular Proteomics,Volume 22, Issue 7,2023,100577,ISSN 1535-9476, https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2023.100577.

【2】J.M. Bader, P.E. Geyer, J.B. Müller, M.T. Strauss, M. Koch, F. Leypoldt, et al.Proteome profiling in cerebrospinal fluid reveals novel biomarkers of Alzheimer’s disease. Mol. Syst. Biol., 16 (2020), Article e9356.

【3】S. Hartwig, A. Czibere, J. Kotzka, W. Paßlack, R. Haas, J. Eckel, et al. Combinatorial hexapeptide ligand libraries (ProteoMiner): an innovative fractionation tool for differential quantitative clinical proteomics Arch. Physiol. Biochem., 115 (2009), pp. 155-160.

【4】L. Dayon, O. Cominetti, M. Affolter Proteomics of human biological fluids for biomarker discoveries: technical advances and recent applications .Expert Rev. Proteomics, 19 (2022), pp. 131-151 .

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