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1990年，Norman Iscove課題組，使用PCR技術實現(xiàn)了對cDNA分子的指數(shù)級擴增，首次證實對單細胞進行轉錄組分析是可行的[1]。
20世紀90年代初期，Eberwine等人發(fā)明了一種新技術，能夠從單個活神經元細胞中獲得cDNA，并且再以這些cDNA為模板轉錄生成RNA，實現(xiàn)RNA的線性擴增[2]。
2008年發(fā)展出了高通量RNA測序技術（二代測序），隨后科研人員將高通量測序技術與之前發(fā)展起來的核酸擴增技術結合起來，對單細胞轉錄組進行了更加精細的研究。最早出現(xiàn)的單細胞RNA擴增方法結合二代測序方出現(xiàn)在2009年，即Tang’s method[3] 。
Tang方法利用PCR進行擴增會引入大量擴增副產物，2012年Sten Linnarsson實驗室在《Cell Report》發(fā)表了CEL-seq技術，他將線性擴增的方法替代PCR反應[4]。
從此，越來越多修飾和改進的單細胞RNA測序技術被開發(fā)出來，引入了在樣本收集、單細胞捕獲、條形碼逆轉錄、cDNA擴增、文庫制備、測序和生物信息學分析等方面的必要修飾和改進。最重要的是，成本顯著降低，而自動化和通量顯著提高。
scRNA-seq的通量從幾個細胞增加到數(shù)十萬個細胞，而成本大大降低，這得益于scRNA-seq技術的快速發(fā)展，如基于微流控、微孔、液滴的技術以及原位條形碼和空間轉錄組分析等。
scRNA-seq的步驟主要包括單細胞分離和捕獲、細胞裂解、反轉錄、cDNA擴增和文庫制備（。單細胞捕獲、反轉錄和cDNA擴增是文庫制備步驟中最具挑戰(zhàn)性的部分。隨著多種測序平臺的發(fā)展，RNA-seq文庫制備技術也呈現(xiàn)出快速而多樣化的發(fā)展。因此，了解不同單細胞RNA測序文庫制備方法的特點和應用，以便在科學研究中做出適當?shù)倪x擇，更好地將這些技術應用于臨床。
單細胞分離和捕獲是從組織中捕獲高質量的單個細胞的過程，從而提取精確的遺傳和生化信息，并促進獨特的遺傳和分子機制的研究。組織塊（bulk）樣本傳統(tǒng)的轉錄組、表觀基因組或蛋白質組只能捕獲來自組織/器官的整體信號，無法區(qū)分單個細胞的變異。單細胞的分離和捕獲方法因生物體、組織或細胞特性而有很大的不同。細胞分離可以通過分離整個細胞、細胞特異性的細胞核或細胞特異性細胞器，甚至分離表達特異性標記蛋白的細胞來完成。最常見的單細胞分離和捕獲技術包括有限稀釋、熒光激活細胞分選（FACS）、磁珠激活細胞分選、微流控系統(tǒng)和激光顯微切割。單個捕獲的關鍵結果，特別是在高通量中，是每個單細胞被捕獲在一個孤立的反應混合物中，其中單個細胞的所有轉錄本將被加上唯一的條形碼轉換為cDNA。
在將RNA轉化為第一鏈cDNA后，得到的cDNA可以通過PCR或體外轉錄（IVT）進行擴增。PCR作為非線性擴增過程應用在Smart-seq、Smart-seq2、Fluidigm C1、Drop-seq、10x Genomics、MATQ-seq、Seq-Well和DNBelab C4。目前存在兩種PCR擴增策略。一種采用SMART技術，利用Moloney鼠白血病病毒逆轉錄酶的轉移酶和鏈轉換活性，整合模板轉換寡核苷酸作為接頭進行下游PCR擴增。該方法是目前最常用的cDNA擴增方法。另一種策略是將cDNA的5’端與poly（A）或poly（C）連接，以在PCR反應中構建通用的接頭。IVT是另一種擴增方法和線性擴增過程，用于CEL-seq、MARS-Seq和inDrop-seq方法中。它需要對擴增的RNA進行額外一輪的逆轉錄，這會導致額外的3’端覆蓋偏倚性。這兩種方法都可能導致擴增偏倚。為了克服擴增相關的偏倚性，在反轉錄步驟中引入獨特的分子標記（UMI）對細胞內的每個單個mRNA分子加上條形碼，從而提高scRNA-seq的定量性質，并通過有效消除PCR擴增偏倚提高了讀取精度。
單細胞RNA測序技術在過去十年中已被證明是生命科學領域的一項革命性技術。高通量單細胞RNA測序技術和計算工具的發(fā)展，使得該技術在生命科學中的幾乎所有應用領域都可獲得和應用。單細胞RNA測序技術的一個重要基礎知識是在組織、器官和有機體中構建單細胞圖譜。為此，在研究和建立細胞圖譜方面作出了相當大的努力，全身單細胞圖譜已經應用于秀麗隱桿線蟲、渦蟲、黑腹果蠅、斑馬魚、小鼠、獼猴和人類。隨著技術和應用的發(fā)展，預計將產生越來越多的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)，并將其集成到一個可公開訪問的數(shù)據(jù)庫中，以促進了解基因和細胞在健康和疾病中的功能。
【1】Brady G , Barbara M , Iscove N N . Representative in Vitro cDNA Amplification From Individual Hemopoietic Cells and Colonies[J]. Methods in Molecular and Cellular Biology, 1990, 2(1)【2】Eberwine J , Yeh H , Miyashiro K , et al. Analysis of gene expression in single live neurons.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, 89(7):3010-3014.【3】Tang F , Barbacioru C , Wang Y , et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J]. Nature Methods, 2009, 6(5):377-382. |
