1987年日本科學(xué)家在大腸桿菌的基因組發(fā)現(xiàn)有特別的規(guī)律序列，某一小段DNA會(huì)一直重復(fù)，重復(fù)片段之間又有相等長(zhǎng)的間隔，此序列稱為 CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)。它是存在于細(xì)菌中的一種基因，該類基因組中含有曾經(jīng)攻擊過(guò)該細(xì)菌的病毒的基因片段。細(xì)菌透過(guò)這些基因片段來(lái)偵測(cè)并抵抗相同病毒的攻擊，并摧毀其DNA。這類基因組是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。透過(guò)這些基因組，人類可以準(zhǔn)確且有效地編輯生命體內(nèi)的部分基因，也就是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。
CRISPR/Cas系統(tǒng)，為目前發(fā)現(xiàn)存在于多數(shù)細(xì)菌與絕大多數(shù)的古菌中的一種后天免疫系統(tǒng)[1]，以消滅外來(lái)的質(zhì)?；蛘呤删w，并在自身基因組中留下外來(lái)基因片段作為“記憶”。目前已發(fā)現(xiàn)三種不同類型的 CRISPR/Cas系統(tǒng)，存在于大約40%和90%已定序的細(xì)菌和古菌中[2]。其中第二型的組成較為簡(jiǎn)單，以Cas9蛋白以及向?qū)NA（gRNA）為核心的組成。
CRISPR-Cas9系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)基礎(chǔ)研究，遺傳疾病基因治療，動(dòng)植物育種改良等領(lǐng)域。基于具有缺口酶活性的nCas9(Cas9 nickase)和腺苷/胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的堿基編輯器可實(shí)現(xiàn)A-to-G，C-to-T和C-to-G的堿基替換。
DNA堿基編輯不依賴雙鏈斷裂，具有更安全，更精準(zhǔn)的特性，使得其在遺傳疾病治療中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。然而由于Cas9的體積過(guò)大，基于nCas9的堿基編輯器難以實(shí)現(xiàn)單個(gè)AAV(腺相關(guān)病毒)的包裝遞送，極大限制了在體基因編輯的發(fā)展應(yīng)用。
在過(guò)去十年里，基于CRISPR的基因編輯技術(shù)得到了快速發(fā)展，并被成功應(yīng)用放到了人體臨床試驗(yàn)中已治療遺傳疾病和癌癥。與此同時(shí)，全世界的科學(xué)家們也在不斷挖掘新的具有基因編輯潛力的新工具，以解決現(xiàn)有基因編輯工具太大難以被單個(gè)AAV載體遞送的問(wèn)題。
2021年9月，張鋒團(tuán)隊(duì)在 Science 期刊發(fā)表論文[3]，發(fā)現(xiàn)了一類廣泛的轉(zhuǎn)座子編碼的RNA引導(dǎo)核酸酶，并將其命名為OMEGA系統(tǒng)（包括IscB、IsrB、Tnp8），它們同樣使用一段RNA（ωRNA）來(lái)指導(dǎo)切割DNA雙鏈。
其中IscB被認(rèn)為是Cas9的祖先，更重要的是，IscB非常小，大約400個(gè)氨基酸，僅為Cas9的約30%，這意味著它們可被開(kāi)發(fā)為新的小型化基因編輯工具，從而更容易被遞送到細(xì)胞內(nèi)。后續(xù)研究人員發(fā)表了一系列論文，解析了IscB-ωRNA的結(jié)構(gòu)，及其切割DNA的機(jī)制。
2023年5月25日，楊輝團(tuán)隊(duì)在 Nature Methods 期刊發(fā)表了題為：Development of miniature base editors using engineered IscB nickase 的研究論文[4]。該研究對(duì)IscB進(jìn)行了大量?jī)?yōu)化和改造，獲得了在人類細(xì)胞中具有高效基因編輯活性的IscB變體——enIscB。將enIscB切口酶分別與腺苷脫氨酶和胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域融合，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出了迷你型堿基編輯器——miABE和miCBE。這些迷你型堿基編輯器在真核細(xì)胞中顯示出強(qiáng)大的單堿基編輯效率，最高可達(dá)92%。
總的來(lái)說(shuō)，該研究建立了enIscB-T5E和miBE作為基因組編輯的通用工具。更重要的是，miBE不僅具有高堿基編輯活性，還具有迷你尺寸的特點(diǎn)，有助于解決當(dāng)前堿基編輯工具太大而無(wú)法被單個(gè)AAV載體遞送的難題，為體內(nèi)堿基編輯的應(yīng)用帶來(lái)了新的可能性。
【1】Westra, Edze R.; Swarts, Daan C.; Staals, Raymond H.J.; Jore, Matthijs M.; Brouns, Stan J.J.; van der Oost, John. The CRISPRs, They Are A-Changin': How Prokaryotes Generate Adaptive Immunity. Annual Review of Genetics. 2012-12-15, 46 (1): 311–339 [2020-10-12]. ISSN 0066-4197. doi:10.1146/annurev-genet-110711-155447.【2】Grissa, Ibtissem; Vergnaud, Gilles; Pourcel, Christine. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics. 2007, 8 (1): 172 [2020-10-12]. doi:10.1186/1471-2105-8-172.【3】Antibody dru Altae-Tran, H., Kannan, S., Demircioglu, F.E., Oshiro, R., Nety, S.P., McKay, L.J., Dlaki?, M., Inskeep, W.P., Makarova, K.S., Macrae, R.K., et al. (2021). The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science 374, 57-65.【4】Han, D., Xiao, Q., Wang, Y. et al. Development of miniature base editors using engineered IscB nickase. Nat Methods (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01898-9.
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