簡(jiǎn)介
活力測(cè)定是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的一種篩選工具，用于評(píng)估細(xì)胞系對(duì)感興趣化合物或不同生長(zhǎng)條件的反應(yīng)。確定細(xì)胞活率有很多種方法，其中有一些方法可以提供“全孔”的信息-例如ATP生物發(fā)光檢測(cè)，或使用MTT、WST-1或刃天青的比色分析。同時(shí)，也有一些方法是基于熒光成像技術(shù)在個(gè)體水平上對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分?；诩?xì)胞膜的通透性和細(xì)胞核的可及性，這些熒光活率標(biāo)記物通常會(huì)與適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡標(biāo)記物結(jié)合。
Tecan推出的Spark Cyto細(xì)胞成像系統(tǒng)整合了酶標(biāo)儀的多功能檢測(cè)能力和精密的成像模塊，可以直接對(duì)微孔板中的細(xì)胞樣本進(jìn)行明場(chǎng)和熒光成像。它可以在同一實(shí)驗(yàn)中完成細(xì)胞樣本的可視化和功能性檢測(cè)分析。該系統(tǒng)含有功能強(qiáng)大且易用的SparkControl™軟件，它已具有許多預(yù)定義的方案，能簡(jiǎn)化常見的基于細(xì)胞分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。這其中包括使用酯化鈣黃綠素結(jié)合碘化丙啶（PI）的細(xì)胞活率應(yīng)用。酯化鈣黃綠素是一種非熒光的透膜性化合物，通過活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的酯酶活性裂解產(chǎn)生綠色熒光的不可透膜化合物鈣黃綠素。相反，PI在活細(xì)胞中是不透膜的，可以根據(jù)其紅色熒光檢測(cè)死細(xì)胞。
本技術(shù)手冊(cè)介紹了經(jīng)二甲基亞砜（DMSO）或皂素處理后，人宮頸癌（HeLa）細(xì)胞活率的準(zhǔn)確且快速的定量方法。
材料和方法
在37°C和5% CO2的潮濕環(huán)境中，HeLa細(xì)胞在添加過1 0 % 胎牛血清（F B S ） 的R P M I 培養(yǎng)基（ G i b c o ，#12633012）中生長(zhǎng)匯合。然后，使用胰蛋白酶/EDTA收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并播種到24孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)為5 × 104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液為500μl。將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)的孵育條件下過夜。
在初始試驗(yàn)中，加入DMSO至終濃度為2 0 %或4 0 %（v/v），37℃孵育細(xì)胞45 min誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在第二次試驗(yàn)中，將不同濃度的皂素（0.05%和0.2% v/v在培養(yǎng)基中）在37℃條件下作用10 min。在這兩種情況下，未處理的對(duì)照微孔都包括在內(nèi)。
熒光染色時(shí)，將酯化鈣黃綠素和PI的工作液用PBS稀釋至終濃度分別為100 ng/ml和1 pg/ml。將染色液直接加入細(xì)胞樣品（300μl/孔），室溫下避光孵育30分鐘。用于串色校正僅用PI染色的孔也包括在內(nèi)。
使用細(xì)胞活率應(yīng)用程序進(jìn)行圖像采集，參數(shù)設(shè)置如表1所示。在Live Viewer™（可通過方法編輯器訪問）中對(duì)曝光時(shí)間、LED強(qiáng)度和對(duì)焦補(bǔ)償?shù)葏?shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以確保在每個(gè)顏色通道中都能檢測(cè)到足夠的熒光強(qiáng)度，而不會(huì)過度曝光。通過測(cè)定僅用PI染色良好的參照樣品的綠色熒光信號(hào)，并最大限度地減少該通道中的光量來進(jìn)行串色校正。
我們通過使用Method Editor或Image Analyzer中的長(zhǎng)度、寬度和識(shí)別靈敏度設(shè)置，來優(yōu)化綠色和紅色物體的檢測(cè)率。
表1：使用綠色和紅色熒光通道，評(píng)估細(xì)胞活力的檢測(cè)參數(shù)設(shè)置。
結(jié)果
添加濃度為40%的DMSO可導(dǎo)致細(xì)胞活率顯著下降，同時(shí)PI陽性細(xì)胞數(shù)量從背景水平增加到50%左右。然而，濃度為20%的DMSO對(duì)這個(gè)著名且健壯的細(xì)胞模型影響很?。▓D1）。此外，添加濃度為40%的DMSO導(dǎo)致死亡細(xì)胞從微孔表面分離，可能會(huì)高估活率水平（如圖2所示），總體可以看到處理孔比對(duì)照孔的細(xì)胞更少。
相比之下，相對(duì)較低濃度的皂素會(huì)立即導(dǎo)致膜喪失完整性，但不會(huì)使細(xì)胞從孔板表面脫離。處理后細(xì)胞活率約有10%的顯著下降，其皂素含量為0.2%（圖3），大多數(shù)細(xì)胞PI染色呈陽性（圖4）。
細(xì)胞活率的評(píng)估也可以隨著時(shí)間的推移進(jìn)行，例如動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。對(duì)于這種應(yīng)用，建議使用環(huán)境控制功能，如對(duì)溫度和濕度進(jìn)行控制，以及為細(xì)胞株選定適當(dāng)?shù)?/span>CO2壓力。然而，根據(jù)細(xì)胞株的不同，還應(yīng)注意的是，鈣黃綠素會(huì)在染色數(shù)小時(shí)后會(huì)被主動(dòng)運(yùn)送出細(xì)胞外。
結(jié)論
Spark Cyto預(yù)定義的細(xì)胞活率應(yīng)用程序提供了一個(gè)可靠且易于使用的方式，來檢測(cè)和定量化合物的細(xì)胞毒性效應(yīng)，如文中DMSO或皂素對(duì)HeLa細(xì)胞的影響。該系統(tǒng)的ImageAnalyzer軟件可以直接優(yōu)化綠色和紅色物體的識(shí)別靈敏度。此外，還可以通過調(diào)節(jié)大小或強(qiáng)度的門控來排除過度曝光的物體或偽影的干擾。
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/） | 
