簡(jiǎn)介
嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)由于其傳播速度快，已成為全球關(guān)注的問(wèn)題。目前，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)測(cè)和量化SARS-CoV-2感染的方法既耗時(shí)又費(fèi)力。然而，法蘭克福大學(xué)創(chuàng)建的睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)——一個(gè)強(qiáng)大且多功能的細(xì)胞感染模型，可使研究人員能夠低成本高效率地在體外高通量監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2的復(fù)制。
本應(yīng)用指南來(lái)自于法蘭克福大學(xué)于2021年7月發(fā)表在《微生物學(xué)前沿》上的一篇論文。該研究描述了使用SparkCyto開(kāi)發(fā)細(xì)胞模型，實(shí)現(xiàn)針對(duì)SARS-CoV-2的高通量研究。
Spark Cyto全自動(dòng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)用于本次研究，它的成像模塊包含三個(gè)可選擇的物鏡和四個(gè)熒光通道。該儀器的照明和自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)都是基于LED，可以在微孔板中實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的明場(chǎng)成像。該研究還充分利用了Spark Cyto的高度靈活性，實(shí)現(xiàn)了在受控環(huán)境下長(zhǎng)達(dá)198小時(shí)的活細(xì)胞成像，使用明場(chǎng)和紅色熒光通道監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2復(fù)制誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPEs)。
該系統(tǒng)的易用軟件 SparkControl™提供各種功能，包括調(diào)節(jié)溫度、CO2和蒸發(fā)保護(hù)等環(huán)境控制，以及動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)置。這些功能支持復(fù)雜的細(xì)胞分析，包括細(xì)胞活力、凋亡、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞死亡。在這些應(yīng)用中，匯合度評(píng)估提供了一個(gè)有效的無(wú)標(biāo)記替代方法來(lái)評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)行為。在SparkControl的con uence應(yīng)用程序中可以獲得粗糙度系數(shù)，它提供了一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞毒性、細(xì)胞分裂，甚至是微孔中的細(xì)胞被細(xì)菌或酵母污染水平的測(cè)量方法，而不需要進(jìn)行熒光染色（圖1）。SparkControl將粗糙度系數(shù)計(jì)算為包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的所有分離區(qū)域的像素強(qiáng)度的歸一化平均標(biāo)準(zhǔn)偏差。無(wú)量綱化的粗糙度系數(shù)的值可以在零到無(wú)窮之間，并可以與專有的圖像分析軟件Image Analyzer™結(jié)合，提供對(duì)象遮罩的簡(jiǎn)單優(yōu)化，以微調(diào)結(jié)果。
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中研究細(xì)胞的各種特性，以構(gòu)建和表征一個(gè)合適的細(xì)胞系。例如，選擇高轉(zhuǎn)染效率和對(duì)胰蛋白酶有良好反應(yīng)是至關(guān)重要的。為此，我們用GFP編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用綠色熒光計(jì)數(shù)功能來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。用胰蛋白酶處理融合細(xì)胞，DAPI染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞分離情況。結(jié)合其他特點(diǎn)，如對(duì)干擾素處理有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，最終選擇細(xì)胞株A 5 4 9 來(lái)生成體外模型。然后對(duì)選定的細(xì)胞株進(jìn)行SARS-CoV-2感染研究。
CPEs表明感染病毒引起的宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，是通過(guò)匯合度減少和粗糙度評(píng)估確定的。與匯合度的減少相比，由于SARS-CoV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變，粗糙度系數(shù)有更大的增加。這是由于SARS-CoV-2糖蛋白介導(dǎo)的膜融合形成合胞體所致。
SARS-CoV-2的進(jìn)入宿主細(xì)胞高度依賴于ACE2受體和TMPRSS2蛋白酶的表達(dá)。為了監(jiān)測(cè)這一點(diǎn)，A549-AT細(xì)胞中另外含有一個(gè)dTomato的序列作為ACE2組成性表達(dá)構(gòu)建的一部分，允許用紅色熒光成像檢測(cè)SARS-CoV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解。該方法被用于確定單克隆中和抗體(mAbs)的有效性，證明該細(xì)胞系適合用于藥物篩選和病毒學(xué)分析。
結(jié)果
通過(guò)抗體介導(dǎo)的免疫熒光檢測(cè)病毒蛋白，證明所觀察到的匯合度變化、粗糙度增加和紅色熒光減少是由病毒特異性誘導(dǎo)的。
在SARS-CoV-2研究中，高通量細(xì)胞模型的主要前提是容易培養(yǎng)、良好的重現(xiàn)性和明顯的干擾素反應(yīng)。在評(píng)估了不同細(xì)胞株對(duì)I-III型干擾素反應(yīng)的敏感性后，初步選擇了兩種合適的候選細(xì)胞株A549和Caco2，并根據(jù)增殖率、胰蛋白酶消化和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步分析細(xì)胞培養(yǎng)特性。在Spark Cyto上使用自動(dòng)匯合度測(cè)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)功能，在16天的時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。人肺上皮細(xì)胞株A549在第8天達(dá)到完全匯合。此外，A549在分裂實(shí)驗(yàn)前的分離時(shí)間明顯縮短，且轉(zhuǎn)染效率高于Caco2細(xì)胞。數(shù)據(jù)證實(shí)，A549細(xì)胞在高通量分析中表現(xiàn)出適合作為研究SARS-CoV-2感染的細(xì)胞模型的特征。
ACE2和TMPRSS2是SARS-CoV-2進(jìn)入病毒細(xì)胞的必要受體，利用促芽孢桿菌素S脫氨酶（BSD）作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建出有ACE2- dTomato表達(dá)的A549（圖3）。在EF1 α啟動(dòng)子的控制下使用類似的構(gòu)建，用藍(lán)色熒光蛋白(BFP)和濕霉素抗性基因單元(HygR)組成表達(dá)TMPRSS2。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同表達(dá)水平的細(xì)胞進(jìn)行分選。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549-ACE2高 / TMPRSS2低細(xì)胞(A549-AT)是SARS-CoV-2引起的CPE變化最明顯的細(xì)胞系。
用SARS-CoV-2菌株FFM1（2020年初從中國(guó)武漢的一名個(gè)體中分離）感染細(xì)胞，并進(jìn)行RT-qPCR分析。檢測(cè)到可作為活性復(fù)制和病毒釋放的替代標(biāo)記物的特定病毒mRNA，表明生產(chǎn)性感染也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生感染性病毒。
使用Spark Cyto的自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)非侵入性SARS-CoV-2復(fù)制。再次用SARS-CoV-2 FFM1毒株感染細(xì)胞，僅在感染后12小時(shí)觀察到CPE的形成和匯合度的減少（圖4）。由于合胞體的形成和細(xì)胞裂解，粗糙度系數(shù)增加。細(xì)胞粗糙度是估計(jì)CPE的一個(gè)很好的標(biāo)記，因?yàn)樗霈F(xiàn)在匯合度變化之前。
A549 - AT 細(xì)胞用于顯示各種SARS-CoV-2分離株的CPE，包括Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)和Zeta (P.2)變異株，這些變異與更高的傳播或免疫逃避有關(guān)。除了匯合度減少和粗糙度系數(shù)增加外，病毒感染時(shí)dTomato信號(hào)的丟失是監(jiān)測(cè)CPE形成的另一種節(jié)約時(shí)間和資源的高效讀取方法。
所有這些數(shù)據(jù)表明A549-AT模型細(xì)胞株適用于各種自動(dòng)化讀取方法來(lái)確定SARS-CoV-2的復(fù)制。接著對(duì)構(gòu)建的細(xì)胞株進(jìn)行了評(píng)價(jià)和測(cè)試以確定其在藥物篩選中的可用性，包括抗病毒藥物和單克隆抗體篩選。首先用瑞德西韋和卡莫司他處理細(xì)胞，這導(dǎo)致了病毒復(fù)制的顯著減少（數(shù)據(jù)見(jiàn)參考文獻(xiàn)原文圖6）。由于單克隆抗體和患者源血清的中和滴度是影響SARS-CoV-2免疫的重要因素，因此采用A549-AT細(xì)胞進(jìn)行相互抗體滴度測(cè)定。商業(yè)單抗bamlanivimab (LY-CoV555)可以有效地中和SARS-CoV-2變異株B.1.1.7以及2020年初的分離株B。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞匯合度和粗糙度系數(shù)，以及dTomato表達(dá)的熒光測(cè)量—稱為相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFI)——可以觀察到中和抗體對(duì)CPE形成的濃度依賴性效應(yīng)。然而，對(duì)B.1.351或P.2變異株均不存在中和效應(yīng)（圖5）。這些數(shù)據(jù)表明，自動(dòng)化評(píng)估中和抗體的效力是可行的。
結(jié)論
自動(dòng)化無(wú)創(chuàng)光學(xué)讀取方法，包括對(duì)匯合度和粗糙度系數(shù)的評(píng)估，以及dTomato的熒光測(cè)量。此外，本文還進(jìn)行了活細(xì)胞成像和長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)研究。Spark Cyto的高靈活性非常適合于自動(dòng)化，可對(duì)SARS-CoV-2感染進(jìn)行高通量、低成本的研究。綜上所述，A549-AT細(xì)胞適合作為SARS-CoV-2感染研究中的高通量模型細(xì)胞株。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該細(xì)胞株可用于篩選抗病毒化合物， 以及研究針對(duì)不同SARS-CoV-2變種的中和抗體的有效性。
參考文獻(xiàn)
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Toptan, T et al. Optimized qRT-PCR approach forthe detection of intra- and extra-cellular SARS-CoV-2RNAs. INT J MOL SCI, 2020, 21 (12), 4396. doi.org/10.3390/ijms21124396.
（文章來(lái)源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654352961670008832） | 
