簡介
鈣離子（Ca2+）是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中重要的第二信使，參與基因表達、增殖、分化和細胞死亡等關(guān)鍵細胞過程。Ca2+濃度在細胞外（1.5 mM）和細胞內(nèi)（胞漿內(nèi)100 nM）以及細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異。細胞外Ca2+進入細胞內(nèi)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放存儲在細胞內(nèi)的Ca2+，會使胞漿內(nèi)Ca2+濃度增加，從而啟動細胞內(nèi)Ca2+信號通路。質(zhì)膜上還有幾個離子通道控制Ca2+從細胞外進入細胞內(nèi)，例如電壓門控鈣通道（VGCCs）。
細胞內(nèi)異常的Ca2+信號傳導和Ca2+紊亂與多種疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病和各種癌癥。此外，鈣離子通道的高水平表達與治療性抗拒、干細胞狀態(tài)、自我更新和癌細胞的遷移能力有關(guān)。幾種常見的化療藥物會干擾癌細胞中的Ca2+穩(wěn)定性和Ca2+信號傳導。因此，對細胞內(nèi)Ca2+的監(jiān)測是一種有用且應用廣泛的實驗方法。
Fluo-4是一種經(jīng)典熒光染料用于監(jiān)測細胞內(nèi)Ca2+，其與Ca2+結(jié)合后綠色熒光增強。將溶解好的Fluo-4直接添加到含有培養(yǎng)細胞的微孔板中，細胞可以載入乙酰氧基甲酯（AM）形式的Fluo-4，然后可以通過標準熒光檢測或基于熒光的細胞成像檢測Fluo-4。
在Spark Cyto上可以同時實現(xiàn)這兩種功能。該系統(tǒng)是第一臺活細胞實時成像酶標儀，可實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的半自動化實驗流程。它將多功能檢測模塊和熒光成像相結(jié)合，可以在單個實驗中對細胞樣本進行可視化和功能檢測。
Spark Cyto配備了高端成像模塊，包括三個可選的物鏡、四個熒光通道、一個LED照明和高度可靠、快速自動的聚焦系統(tǒng)。通過用戶友好和直觀的SparkControl™軟件，Spark Cyto可以實現(xiàn)動力學分析的自動化，如全環(huán)境控制、動力學軟件和動態(tài)調(diào)節(jié)能力，為復雜的實驗設(shè)計提供了一套簡單的解決方案。
本文描述了一種使用Spark Cyto多色熒光成像和ImageAnalyzer™軟件分析胞內(nèi)Ca2+濃度和Ca2+攝取的半高通量方法。通過鈣離子載體-離子霉素處理增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，用Fluo-4結(jié)合使用細胞核染料Hoechst 33342進行定量檢測。
材料和方法
細胞培養(yǎng)
KKU-055細胞（人膽管癌細胞系；JCRB）在標準細胞培養(yǎng)條件下（37°C，5%CO2），在DMEM培養(yǎng)基（Gibco）中，生長至約80%匯合度。DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，Biochrom），1%抗生素-抗真菌溶液（ABAM，Merck），1mM丙酮酸鈉（Merck），以及10mM HEPES（Merck）。
試劑
將Hoechst 33342溶液（20 mM，ThermoFisherScienti?c）、Fluo-4、AM（ThermoFisher Scienti?c，溶解于DMSO中至1 mM的濃度） 和離子霉素（Merck，溶解于DMSO中至1 mM的濃度）分裝，并在-20°C下儲存。
染色和離子霉素處理
用胰蛋白酶/EDTA（Merck）處理收集細胞，并以每孔7500個細胞的密度接種在96孔板（Tecan）中，過夜培養(yǎng)。用無血清的DMEM（sfDMEM）清洗細胞一次，加入Hoechst 33342（1μM）和Fluo-4（0.5μM），在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10分鐘。在培養(yǎng)孔中添加離子霉素（1μM）后立即開始檢測。
儀器
Spark Cyto 600
檢測方案和分析
熒光成像（藍色通道檢測Hoechst細胞核染料，綠色通道檢測Fluo-4陽性細胞）通過動力學循環(huán)（5個周期，每個周期2分鐘）檢測胞內(nèi)Ca2+的時間依賴性變化。為了分析單細胞水平的胞內(nèi)Ca2+，并驗證實驗方案的動態(tài)適用性，動力學循環(huán)設(shè)置一個條件（每孔計數(shù)5000個帶綠色熒光的細胞）。使用Image分析軟件的Voronoi分析功能分析雙陽性細胞，并確保單細胞水平的可靠測量。為了評估Voronoi分析的特異性，同時使用了多色熒光成像儀的分析功能，兩者選用相同的分析選項設(shè)置。有關(guān)詳細設(shè)置，請參見圖1。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計
所有數(shù)據(jù)點代表7次重復的平均值，±標準平均誤差（SEM）。使用OriginPro®2019b（OriginLab）進行計算。
結(jié)果和討論
使用動力學循環(huán)功能，可以可靠地監(jiān)測離子霉素處理后細胞內(nèi)Ca2+的增加，并為隨后在單細胞水平上分析細胞內(nèi)Ca2+定義了一個條件（5000個綠色熒光的細胞）。實驗數(shù)據(jù)如圖2所示。
為了在細胞水平上檢測鈣流的大小，把多色熒光成像與Voronoi分析相結(jié)合。同時檢測藍色和綠色的雙陽性細胞，代表胞內(nèi)鈣流增加。此外，為了檢測Voronoi分析的特異性，對常規(guī)（非Voronoi）分析進行了相同的實驗。
正如預期的那樣，分析模式（Voronoi與非Voronoi）對與核染色相關(guān)的結(jié)果沒有影響（圖3）。然而，與非voronoi相比，Voronoi分析導致了“帶綠色信號的藍色目標計數(shù)”（即雙染色細胞，見圖4）的值相對更低。如圖5所示，這種現(xiàn)象是由于Voronoi分析的特定算法，從而減少了假陽性。非Voronoi分析會產(chǎn)生重疊計數(shù)事件，因此會產(chǎn)生假陽性信號（圖5，上），而使用Voronoi分析可以更精確地解決這些重疊計數(shù)事件（圖5，下）。
結(jié)論
將多色熒光成像與Voronoi分析相結(jié)合是實時測量細胞水平鈣離子變化的可靠工具。此外，結(jié)合Ca2+敏感染料和核染色可以在細胞水平上分析細胞內(nèi)Ca2+。在這個設(shè)置中，Voronoi分析優(yōu)于非Voronoi分析，因為它最小化了假陽性結(jié)果。這里提供的方案是可擴展的，適用于半高通量的應用。
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654332953925570560） | 
