簡(jiǎn)介
HTRF是基于時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）的檢測(cè)系統(tǒng)，廣泛用于分析不同分子間相互作用和結(jié)合的研究。該技術(shù)基于長(zhǎng)壽命的銪或鋱穴合物供體與各種紅色或者綠色受體間的能量轉(zhuǎn)移，并結(jié)合了FRET和TRF兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。
HTRF技術(shù)需要多功能酶標(biāo)儀具備很高的靈敏度，Spark酶標(biāo)儀的一系列特性可以滿足這些需求，并確保最佳的分析性能。Tecan獨(dú)特的融合光學(xué)系統(tǒng)，在同一機(jī)身上整合了濾光片的靈敏度和單色儀（MCRs）的靈活性。除了單獨(dú)完全使用基于濾光片型檢測(cè)或MCR檢測(cè)外，還可以在同一次檢測(cè)中同時(shí)組合使用這兩種檢測(cè)方法。自動(dòng)Z軸優(yōu)化和集成二向色鏡非常適合HTRF檢測(cè)，進(jìn)一步提高了Spark卓越的靈敏度。本應(yīng)用指南描述了配備標(biāo)準(zhǔn)熒光組件的Spark酶標(biāo)儀用于HTRF檢測(cè)的驗(yàn)證。
材料與方法
• 帶標(biāo)準(zhǔn)熒光模塊的Spark多功能酶標(biāo)儀（Tecan，奧地利）
• 384孔小體積微孔板，黑色和白色（Greiner® Bio-One，
德國(guó)）
• HTRF酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒 （Perkin Elmer cisbio，法國(guó)）
• cAMP HiRange檢測(cè)試劑盒（Perkin Elmer cisbio，法國(guó)）
• Human TNFα檢測(cè)試劑盒（Perkin Elmer cisbio，法國(guó)）
• IP-One Tb檢測(cè)試劑盒（Perkin Elmer cisbio，法國(guó)）
• cAMP-green酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒（內(nèi)部使用非商用，Perkin Elmer cisbio，法國(guó)）
HTRF 酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒(RCK)
HTRF酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒旨在設(shè)置和驗(yàn)證儀器進(jìn)行HTRF測(cè)量的兼容性。它包含評(píng)估單臺(tái)酶標(biāo)儀性能所需的所有試劑和緩沖液，也可用于不同儀器的比較。
Human TNFα檢測(cè)試劑盒
腫瘤壞死因子- α (TNFα)是一種由活化的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，作為急性期免疫應(yīng)答的一部分參與全身炎癥反應(yīng)。
該檢測(cè)試劑盒允許通過抗體介導(dǎo)識(shí)別用HTRF供體和受體熒光基團(tuán)標(biāo)記的兩個(gè)不同的表位來定量細(xì)胞或上清液中的TNFα。HTRF比值隨TNFα濃度呈線性增加。
cAMP HiRange檢測(cè)試劑盒
環(huán)腺苷酸（環(huán)腺苷酸3' -5' -單磷酸，cAMP）是細(xì)胞內(nèi)最重要的信使分子之一，參與蛋白激酶或離子通道的激活等多種生物過程。本試劑盒設(shè)計(jì)用于通過競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析方法直接定量懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞中的cAMP，可檢測(cè)不同細(xì)胞系中GPCRs(G蛋白偶聯(lián)受體)的激動(dòng)劑和拮抗劑作用。HTRF信號(hào)與樣品中cAMP濃度成反比。
IP-1 Tb檢測(cè)試劑盒
G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路主要有三種，通過G蛋白的四個(gè)亞型來介導(dǎo)：Gs、Gi、Gq和G12/13。Gq在GPCR刺激后誘導(dǎo)磷脂酶C(PLC)激活，觸發(fā)IP3（三磷酸肌醇）的生成。IP1（磷酸肌醇，IP3的下游代謝物）會(huì)在Gq受體激活后在細(xì)胞中積累。它在氯化鋰(LiCl)存在下是穩(wěn)定的，因此是GPCR (Gq)功能試驗(yàn)的理想選擇。
IP-One Tb試驗(yàn)是一種競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)，使用鋱穴合物標(biāo)記的抗IP1單克隆抗體和d2標(biāo)記的IP1檢測(cè)累積的IP1。信號(hào)比與樣品中IP1濃度成反比。
試驗(yàn)方案
所有試劑盒都是根據(jù)試劑制造商的說明使用的。為了驗(yàn)證鋱供體/綠色受體結(jié)構(gòu)，將cAMP直接偶聯(lián)到綠色受體，與鋱供體偶聯(lián)的抗cAMP抗體結(jié)合使用。每種試劑盒在384孔微體積板(白色和黑色)中檢測(cè)三次，每孔填充20μl。Spark通過使用融合光學(xué)濾波片/濾光片組合，以及激發(fā)側(cè)的MCR和發(fā)射側(cè)的濾波片進(jìn)行了驗(yàn)證。
使用銪穴合物供體的試劑盒- RCK、cAMP HiRange試劑盒和TNFα試劑盒的檢測(cè)參數(shù)見表1。
使用銪穴合物供體的檢測(cè)參數(shù)
使用鋱穴合物供體（IP-One Tb試劑盒和cAMP + 綠色受體）的檢測(cè)參數(shù)詳見表2。
使用鋱穴合物供體的檢測(cè)參數(shù)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
HTRF酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒
在發(fā)射端選擇濾光片的條件下，Spark酶標(biāo)儀呈現(xiàn)非常好的RCK實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而激發(fā)端選擇濾光片和MCR均符合Cisbio的接受標(biāo)準(zhǔn)。因此在濾光片/濾光片和單色儀/濾光片兩種組合下對(duì)Spark酶標(biāo)儀的HTRF進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果顯示，Spark酶標(biāo)儀適用于HTRF分析。在兩種檢測(cè)模式下，使用白色酶標(biāo)板和黑色酶標(biāo)板，Spark酶標(biāo)儀均符合Cisbio的RCK 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（表3）。使用白色酶標(biāo)板和黑色酶標(biāo)板，所有設(shè)置均顯示非常好的檢測(cè)范圍（FLow 37%，ΔF High ≥ 1,045%）和最小的檢測(cè)誤差（所有校準(zhǔn)器和標(biāo)準(zhǔn)的CVs 濾光片/濾光片組合 ≤ 3.1%，單色儀/濾光片組合 ≤ 6.3%）。
Human TNFα 檢測(cè)試劑盒
Human TNFα 檢測(cè)試劑盒是驗(yàn)證過程中最靈敏的測(cè)試方法，需要高靈敏度的酶標(biāo)儀。根據(jù)評(píng)估方案，TNFα的檢測(cè)極限是基于校準(zhǔn)系數(shù)1到3計(jì)算。在濾光片/濾光片組合下，使用白色和黑色酶標(biāo)板的檢測(cè)極限均低于20 pg/ml。單色儀/濾光片組合下，使用白色酶標(biāo)板超過Cisbio的標(biāo)準(zhǔn)（表4）。因此單色儀/濾光片組合下的檢測(cè)使用白色酶標(biāo)板，濾光片/濾光片組合下可使用白色和黑色酶標(biāo)板，TNFα稀釋檢測(cè)在20和100pg/ml之間呈現(xiàn)線性關(guān)系（R2 ≥ 0.9979）(圖1)。
cAMP HiRange 檢測(cè)試劑盒
如圖2所示，cAMP稀釋系列得到的F值與cAMP濃度呈負(fù)相關(guān)。得到的S型曲線是典型的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定結(jié)果。具體的測(cè)試結(jié)果詳見表5。在每一種情況下，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)空白比20的足夠的動(dòng)態(tài)范圍，EC50值<25 nM。白色酶標(biāo)板在兩種融合光學(xué)配置下呈現(xiàn)非常好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而黑色酶標(biāo)板在濾光片組合下的F和S/B值更低。
IP-One Tb 檢測(cè)試劑盒
IP-One Tb試劑盒用于分析Spark在檢測(cè)鋱穴合物供體與紅色受體實(shí)驗(yàn)的性能。在濾光片/濾光片和單色儀/濾光片組合下使用白色酶標(biāo)板以及濾光片/濾光片組合下使用黑色酶標(biāo)板均符合Cisbio的性能標(biāo)準(zhǔn)（表6）。圖3顯示典型的IP1標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用白色酶標(biāo)板在濾光片/濾光片組合下達(dá)到最好的性能，其他條件下的檢測(cè)結(jié)果顯示減少的F、S/B和EC50值。
cAMP green 酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒
cAMP green 酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒使用與cAMP綠色受體偶聯(lián)的鋱抗cAMP共軛物。該試劑盒用于分析Spark酶標(biāo)儀的HTRF（鋱供體和綠色受體）檢測(cè)性能。所有的融合光學(xué)組合符合Cisbio的標(biāo)準(zhǔn)（表7），但在不同的組合下，黑色微孔板的S/B和EC50值略低于白色微孔板。黑色微孔板在競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)曲線中的F值也明顯偏低（圖4）。
結(jié)論
創(chuàng)新型Spark多功能酶標(biāo)儀采用Tecan獨(dú)特的融合光學(xué)系統(tǒng)提供給客戶更優(yōu)的解決方案。
激發(fā)和發(fā)射均選擇濾光片的條件下，系統(tǒng)在白色和黑色酶標(biāo)板上呈現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在激發(fā)端選擇MCR和發(fā)射端選擇濾光片的條件下，使用白色酶標(biāo)板也符合HTRF的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因此這些組合可視為通過了HTRF驗(yàn)證。除了銪供體的試劑盒外，使用鋱供體加紅色和綠色受體也可進(jìn)行穩(wěn)定靈敏的定量。
綜上所述，本文的研究結(jié)果表明，采用獨(dú)特融合光學(xué)系統(tǒng)的Spark酶標(biāo)儀采用濾光片作為發(fā)射端，完美適用于各種不同的HTRF熒光檢測(cè)。
縮略語(yǔ)表
lHTRF 均相時(shí)間分辨熒光
lTRF 時(shí)間分辨熒光
lFRET 熒光共振能量轉(zhuǎn)移
lMCR 單色儀
lRCK 酶標(biāo)儀質(zhì)控試劑盒
lcAMP 環(huán)腺苷酸3' -5' -單磷酸
lIP3 三磷酸肌醇
lIP1 磷酸肌醇
lGPCR G蛋白偶聯(lián)受體
lTNF 腫瘤壞死因子- α
lPLC 磷酯酶C
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