簡介
轉(zhuǎn)染是研究生物學(xué)功能過程中不可或缺且經(jīng)常使用的實(shí)驗(yàn)方法。因此，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，為了確保細(xì)胞樣本適合下游應(yīng)用，對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行定性和定量評估，是一個常見且重要的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。這項(xiàng)工作通常會涉及到熒光標(biāo)記的使用，如綠色熒光蛋白（GFP）。
通常研究者會使用熒光顯微鏡或單細(xì)胞分析技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)，但是這種方法需要將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離出來，對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行人工評估，而活細(xì)胞成像技術(shù)可以在原位對細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行分析。
Tecan新推出的Spark®Cyto多功能酶標(biāo)儀，內(nèi)部整合了一臺精密相機(jī)，可直接對酶標(biāo)板中的細(xì)胞樣品進(jìn)行明場和熒光成像，并由功能強(qiáng)大且易使用的SparkControl™軟件進(jìn)行控制。SparkControl軟件能夠提供多種預(yù)定義的應(yīng)用方案，并具有用戶自定義功能，可以滿足不同操作者的需求，使用靈活簡便。
SparkControl中的轉(zhuǎn)染效率應(yīng)用程序針對GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化，可配合使用藍(lán)色核染料，如Hoechst 33342或DAPI（見圖1）。
該軟件根據(jù)染色的藍(lán)色細(xì)胞核自動檢測單個細(xì)胞，并識別出那些顯示額外綠色熒光的細(xì)胞，從中計(jì)算并實(shí)時顯示轉(zhuǎn)染效率百分比。
材料與方法
將親代和GFP轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞（分別是CHO和CHO- GFP）置于含10% FBS的Ham 's F-12培養(yǎng)基（Gibco， # 11765054）中， 于37℃，5% CO2的潮濕條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
用胰蛋白酶/EDTA處理并收集兩種細(xì)胞系細(xì)胞，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量。將已知的不同混合比例的轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞種到96孔板來模擬不同轉(zhuǎn)染效率的樣品，每孔200 μl總數(shù)10,000個細(xì)胞（表1）。這些細(xì)胞在熒光染色和圖像采集前被靜置一夜。
檢測前，所有細(xì)胞由 0.01 mg/ml的Hoechst 33342（Thermo Scienti?c）避光室溫染色30分鐘。
使用轉(zhuǎn)染效率應(yīng)用程序進(jìn)行細(xì)胞成像，參數(shù)設(shè)置如表2所示。在本實(shí)驗(yàn)中，使用了4倍物鏡和全微孔成像模式，不僅如此，這些參數(shù)還可以根據(jù)特定的孔板和圖像分辨率要求而變化。圖像采集參數(shù)分別為兩個顏色通道進(jìn)行了優(yōu)化，如LED強(qiáng)度、對焦補(bǔ)償和曝光時間等。當(dāng)使用多個熒光標(biāo)記時，必須糾正串色，因此含綠色標(biāo)記細(xì)胞的參考孔也包含在內(nèi)。
除了成像分析外，還通過對同一孔進(jìn)行多點(diǎn)測量的方式，從底部記錄GFP信號的熒光強(qiáng)度。
多功能檢測和熒光成像能力的結(jié)合，使得細(xì)胞樣品的可視化和功能性檢測能夠在同一實(shí)驗(yàn)中順利完成。
結(jié)果
圖2顯示了使用Spark Cyto的轉(zhuǎn)染效率應(yīng)用程序自動獲取并評估的代表性圖像。
熒光成像測定的轉(zhuǎn)染效率與熒光強(qiáng)度測量結(jié)果相關(guān)，在整個稀釋范圍內(nèi)，兩者呈良好的線性關(guān)系（見圖3）。
結(jié)論
Spark Cyto多功能酶標(biāo)儀非常適合活細(xì)胞成像和細(xì)胞檢測。本技術(shù)手冊中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，為標(biāo)準(zhǔn)成像應(yīng)用預(yù)定義的實(shí)驗(yàn)方案是確定細(xì)胞特征（比如：轉(zhuǎn)染效率）便捷且可靠的工具。它包含的無縫銜接的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置、自動化處理以及結(jié)果的綜合評價，能幫助研究者輕而易舉地計(jì)算出每個樣本的轉(zhuǎn)染效率比。
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654366202039160832） | 
