簡介
AlphaScreen 是一種基于微珠的篩選技術(shù)，旨在快速、可靠且經(jīng)濟(jì)高效地檢測生物分子相互作用。Alpha (ampli?edluminescent proximity homogeneous assay “放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測”的首字母縮寫）技術(shù)使用了由不同的化學(xué)混合物組成的供體微珠和受體微珠，它們可以連接到各種類型的生物相關(guān)分子。在680 nm激光的照射下，供體微珠中的光敏劑苯二甲藍(lán)(Phthalocyanine) 將周圍環(huán)境中的氧分子轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化成一種高能活躍的氧狀態(tài)- 單線態(tài)氧( S i n g l e tOxygen)。單線態(tài)氧小分子的半衰期為4 s，在此期間它們可以在溶液中擴(kuò)散高達(dá)長達(dá) 200 nm的距離。如果在該范圍內(nèi)存在受體微珠，單線態(tài)氧就會觸發(fā)受體微珠的二甲基噻吩衍生物，繼而通過激發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終在520-620 nm產(chǎn)生光信號，從而達(dá)到檢測目的。
AlphaScreen Omnibeads 微珠是一種易于使用、經(jīng)濟(jì)高效的工具，產(chǎn)生 AlphaScreen 信號所需的全部化學(xué)物質(zhì)都在這些微珠中，專為 AlphaScreen 兼容檢測儀器的定期質(zhì)控、酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)而設(shè)計(jì)。
Tecan Spark酶標(biāo)儀配備了增強(qiáng)型檢測模塊，包括用于優(yōu)化 AlphaScreen 供體微珠激發(fā)的高功率激光光源，以及優(yōu)化濾光片組合，非常適用于AlphaScreen，AlphaLISA®，AlphaPlex™ 和潛在的新 Alpha 技術(shù)應(yīng)用的發(fā)射信號超高靈敏檢測。此外，Spark 酶標(biāo)儀還擁有 Tecan 久負(fù)盛譽(yù)的實(shí)時(shí)溫度校正功能，可改進(jìn)微孔板上樣品溫度波動(dòng)帶來的影響。Spark 酶標(biāo)儀還為 Alpha 技術(shù)集成了易于使用、直觀的軟件解決方案和預(yù)先優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)流程，為AlphaScreen,AlphaLISA 和 AlphaPlex 檢測保駕護(hù)航。
本技術(shù)說明主要討論了AlphaScreen 技術(shù)在 Spark 多功能酶標(biāo)儀上的成功應(yīng)用，并介紹了儀器的檢測靈敏度、均一性和讀取時(shí)間等方面的性能。
材料和方法
• Spark 多功能酶標(biāo)儀(Tecan, 奧地利)
• AlphaScreen Omnibeads (PerkinElmer, 美國)
• 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)
• 384孔，白色低容量微孔板（Greiner Bio-One，德國）
利用 Omnibeads 作為代表性化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的最小可檢測信號，對 AlphaScreen 的靈敏度進(jìn)行評估。根據(jù)制造商的說明 (1) 使用 Omnibeads，在避光條件下（<50 lux）移液以防止組件發(fā)生光漂白。簡而言之，在 2.44 至 20,000 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)制備了 Omnibeads 稀釋系列 (1:2)。
將各濃度稀釋液的5份重復(fù)樣品分別添加到 384 孔低容量微孔板（20 l/孔）中；同時(shí)，將不含 Omnibeads 的 PBS緩沖液作為空白對照。此外，將 10,000 ng/ml Omnibeads 稀釋液的復(fù)制品添加到另外單獨(dú)的微孔板上， 以評估AlphaScreen 檢測的均一性。AlphaScreen 檢測的儀器參數(shù)設(shè)置參見表1。
將平均空白校正值與 Omnibeads 的最終濃度作圖，并添加一條線性趨勢線，并將截距設(shè)置為零。檢測限由趨勢線方程 y = kx 確定，使用空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為 y 值。
為了確定檢測的均一性，CV 使用公式 1 計(jì)算：
結(jié)果
靈敏度和線性度
Spark 酶標(biāo)儀能夠檢測低至 1.6 ng/ml 的 Omnibeads 濃度，線性度為 0.9999（R2 值），信號/空白比為 1,154:1（圖2）。
均一性
將 10,000 ng/ml Omnibeads 稀釋液的 50 多份重復(fù)的樣品移液至 384 孔板中。檢測結(jié)果表明信號均一性非常好，CV 值僅為 2.2% 。這表明 Spark 酶標(biāo)儀能夠檢測 AlphaScreen信號，且不會產(chǎn)生顯著的結(jié)果波動(dòng)（圖 3）。
讀取時(shí)間
AlphaScreen 在不同微孔板格式中的總讀取時(shí)間包括激發(fā)和積分時(shí)間，以及應(yīng)用溫度校正功能所需的時(shí)間。通常，我們推薦使用 Alpha檢測的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置，即激發(fā)和積分時(shí)間分別為 100 和 300 毫秒，可以在 4 分 28 秒內(nèi)完成整塊 384孔板的讀取。當(dāng)溫度校正功能激活后，基于 IR 的溫度評估與信號檢測會同時(shí)進(jìn)行，因此檢測時(shí)間會稍微延長。這導(dǎo)致絕大多數(shù)特定微孔板格式的讀取時(shí)間延長約20%。然而，我們可以通過使用更短的激發(fā)和發(fā)射周期（激發(fā)和積分時(shí)間都低至 10 毫秒）來顯著縮短總讀取時(shí)間，同時(shí)為個(gè)性化應(yīng)用提供優(yōu)化方案。
表 2 顯示了 96 孔板和 384 孔板的 AlphaScreen 讀取時(shí)間概覽。
結(jié)論
Spark 酶標(biāo)儀的增強(qiáng)型檢測模塊在 96 孔和 384 孔板格式的靈敏度和均一性等基本質(zhì)量參數(shù)方面，均為 AlphaScreen檢測提供了出色的性能保證。溫度校正功能可用于進(jìn)一步提高分析性能，而無需在檢測前對樣品進(jìn)行耗時(shí)的溫度平衡過程。與 Spark 酶標(biāo)儀經(jīng)典的檢測模式結(jié)合，Alpha 技術(shù)模塊為科學(xué)研究、分析方法的開發(fā)以及高通量篩選等提供了卓越的性能。
參考文獻(xiàn)
1) Using the AlphaScreen Omnibeads.www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73451MAN_AlphaScreenOmniBeads.pdf
(文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654372357725540352) | 
