簡(jiǎn)介
細(xì)胞凋亡——或程序性細(xì)胞死亡——是許多生物學(xué)過(guò)程的核心組成部分，包括發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)的成熟和維持。因此，識(shí)別與區(qū)分凋亡細(xì)胞、死細(xì)胞和活細(xì)胞，在眾多生物學(xué)研究領(lǐng)域中顯得非常重要。
熒光激活細(xì)胞分選（FACS）是區(qū)分凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和活細(xì)胞最常用且成熟的方法之一。然而，它需要對(duì)大量胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行分析，并且通常需要針對(duì)多個(gè)微孔板進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)或不同模式的檢測(cè)。
在健康細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。在細(xì)胞凋亡的早期，PS外翻是細(xì)胞被吞噬的標(biāo)志信號(hào)。一旦PS翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，可被與熒光標(biāo)記（如異硫氰酸熒光素（FITC）或Alexa Fluor®488）結(jié)合的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白annexin V檢測(cè)到。添加第二種不滲透細(xì)胞的染料，如碘化丙啶（PI），可以區(qū)分壞死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染色。PI和FITC/Alexa Fluor 488聯(lián)合使用是區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)中凋亡和壞死的標(biāo)準(zhǔn)流程。在這種情況下，早期凋亡細(xì)胞為annexin V探針信號(hào)較強(qiáng)和PI的熒光信號(hào)較弱或觀察不到熒光信號(hào)，而晚期凋亡細(xì)胞為annexin V和PI雙探針均呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)，如圖1所示。細(xì)胞總數(shù)可以通過(guò)核染色確定，如Hoechst 33342或DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）等細(xì)胞核探針。
Spark Cyto全自動(dòng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)將酶標(biāo)儀的多功能檢測(cè)能力與精密的成像功能巧妙的整合在一起，可直接在微孔板中對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行明場(chǎng)和熒光成像檢測(cè)。與此同時(shí)，功能強(qiáng)大且易用的SparkControl™ 軟件能夠提供大量的預(yù)定義程序，極大簡(jiǎn)化了基于細(xì)胞的常見(jiàn)檢測(cè)分析過(guò)程。
本文通過(guò)使用細(xì)胞死亡應(yīng)用程序，用于評(píng)估A431人鱗狀上皮癌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞毒性劑處理后的細(xì)胞死亡情況。檢測(cè)過(guò)程中，使用了SparkCyto的熒光成像模塊對(duì)PI、annexinV、Hoechest 33342進(jìn)行了熒光成像拍攝。
材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)
A431 細(xì)胞 (ATCC® No. CRL-1555) 在37°C和5% CO2的潮濕條件下，在DMEM高糖生長(zhǎng)培養(yǎng)基（Sigma）中生長(zhǎng)至約70-80%的細(xì)胞密度，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素/鏈霉素、HEPES和5%熱滅活胎牛血清（FCS、PAA實(shí)驗(yàn)室）。然后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并接種到底部透明的96孔黑色組織培養(yǎng)板（Tecan，3012306）中。在200ul培養(yǎng)基中，每孔的密度為7500個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。
誘導(dǎo)凋亡
星孢菌素是一種有效的凋亡誘導(dǎo)劑[1]，使用兩種不同濃度的星孢菌素（#S5921，Sigma-Aldrich）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。簡(jiǎn)而言之，從孔中吸取培養(yǎng)基，添加含有0、1、2μM 星孢菌素的新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)6小時(shí)。吸取含有星孢菌素的培養(yǎng)基，在進(jìn)行染色步驟之前，用PBS清洗細(xì)胞兩次。
染色方法
根據(jù)說(shuō)明書，將Alexa Fluor488標(biāo)記了的Annexin V（#13201，Thermo Scienti?c）與PI結(jié)合使用，以區(qū)分細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞。用Hoechst 33342溶液（#62249，ThermoScienti?c）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，以識(shí)別單個(gè)細(xì)胞核。
染色溶液由以下成分組成：
• 97 μl 1X 結(jié)合液
• 1 μl annexin V-Alexa Fluor 488
• 1 μl PI (0.1 mg/ml stock)
• 1 μl Hoechst 33342 (1 mg/ml stock)
將染色溶液添加到所有實(shí)驗(yàn)孔中，并在光保護(hù)條件下培養(yǎng)15分鐘。未經(jīng)處理的對(duì)照組和僅用annexin V或PI染色的對(duì)照孔，用于信號(hào)串色校正。
每個(gè)細(xì)胞系的特定熒光圖譜可能存在不同，應(yīng)分別進(jìn)行優(yōu)化和建立。此外，應(yīng)針對(duì)每個(gè)細(xì)胞系和細(xì)胞毒性劑優(yōu)化最佳染色條件和分析時(shí)間。
圖像采集與分析
本實(shí)驗(yàn)采用SparkControl軟件熒光成像的預(yù)定義細(xì)胞死亡應(yīng)用程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用10倍物鏡，拍攝每個(gè)孔藍(lán)色、綠色和紅色熒光通道的孔中心圖像。儀器的參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。使用單獨(dú)染色的對(duì)照孔進(jìn)行串色校正。
與所有預(yù)定義的SparkControl應(yīng)用一樣，分析步驟也是預(yù)定義的，可以通過(guò)以下參數(shù)識(shí)別并量化研究對(duì)象：
• 帶有綠色或紅色信號(hào)的藍(lán)色對(duì)象（%）（即帶有藍(lán)色和綠色或藍(lán)色和紅色熒光對(duì)象的百分比）
• 帶有綠色信號(hào)的藍(lán)色對(duì)象
• 帶有紅色信號(hào)的藍(lán)色對(duì)象
• 帶有綠色和紅色信號(hào)的藍(lán)色對(duì)象
• 沒(méi)有綠色或紅色信號(hào)的藍(lán)色對(duì)象
結(jié)果
Spark Cyto的圖像采集結(jié)果顯示，根據(jù)細(xì)胞核的Hoechst染色情況，可以清晰地對(duì)A431細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。此外，經(jīng)星孢菌素處理的annexin V-Alexa Fluor 488（綠色）和PI熒光（紅色）均呈陽(yáng)性，這表明誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（如圖2所示）。
細(xì)胞死亡應(yīng)用分析程序是基于所有三種熒光信號(hào)的鄰近相關(guān)（共定位）效應(yīng)，它能夠幫助識(shí)別和區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。SparkControl軟件能夠獨(dú)特地識(shí)別以下對(duì)象：
• 藍(lán)色對(duì)象 – 細(xì)胞核
• 藍(lán)色/綠色對(duì)象 – 早期凋亡細(xì)胞
• 藍(lán)色/紅色細(xì)胞 – 壞死細(xì)胞
• 藍(lán)色/紅色/綠色對(duì)象 – 晚期凋亡細(xì)胞
這使得用戶可以從數(shù)據(jù)中獲得最大的信息量，以便更恰當(dāng)?shù)亟忉寣?shí)驗(yàn)結(jié)果。
A431細(xì)胞經(jīng)過(guò)添加1μM星孢菌素處理后，可導(dǎo)致約50%細(xì)胞死亡。而對(duì)于使用2μM星孢菌素處理的細(xì)胞樣本，結(jié)果顯示其死亡率進(jìn)一步增加（圖3）。
即使在沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的情況下，一定數(shù)量的細(xì)胞可能會(huì)對(duì)不同標(biāo)記物呈陽(yáng)性。由于所選細(xì)胞系的不同及細(xì)胞聚集效應(yīng)，細(xì)胞凋亡的基線水平會(huì)存在很大差異。因此，通過(guò)研究未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞（無(wú)化合物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)）來(lái)確定這些基線水平顯得非常重要。
結(jié)論
Spark Cyto的熒光成像功能非常適用于各類細(xì)胞檢測(cè)分析。SparkControl軟件中的細(xì)胞死亡應(yīng)用程序，可以有效簡(jiǎn)化針對(duì)使用常用染料染色的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的檢測(cè)分析過(guò)程。
此外，該系統(tǒng)能夠提供全面的環(huán)境控制，包括溫度、氣體和濕度等，以確保細(xì)胞樣本在整個(gè)分析期間都處于理想狀態(tài)。
參考文獻(xiàn)
1) Oberdanner et al. Glucose is required to maintain highATP-levels for the energy-utilizing steps during PDTinducedapoptosis. Photochem Photobiol, 2002; 76(6),695-703.
（文章來(lái)源;hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654386208906989568） | 
