簡介
細胞表型（包括形態(tài)和分子特征）的動態(tài)變化監(jiān)測對于揭示環(huán)境刺激或基因干擾下的細胞響應(yīng)的機制至關(guān)重要。雖然許多分子標記物（如細胞表面標記物，報告蛋白或小分子）可以用于單細胞表型，但這些分析通常是在單一預定終點進行的。
常見的基于流式細胞術(shù)的方法需要終止實驗而獲取細胞群，由于使用長時間和勞動密集型的步驟，因而妨礙了對細胞表型變化的實時和動態(tài)分析。然而，細胞狀態(tài)的變化是動態(tài)的，并且在許多情況下，細胞表型發(fā)生改變的開始時間和分子變化的事件是未知的。因此，終點分析并不能準確描述表型變化及其程度，可能產(chǎn)生令人困惑的結(jié)果。
相比之下，在單細胞水平上的動態(tài)測量可以確定表型改變的動力學，以及短暫和長期改變之間的分化，還有助于識別環(huán)境刺激、適應(yīng)性反應(yīng)和間接效應(yīng)之間的潛在因果聯(lián)系。通常，這些測量主要是在報告細胞系/菌株中進行的，需要對感興趣的生物進行基因修飾。不幸的是，目前可以在任何感興趣的時間點執(zhí)行、允許動態(tài)和連續(xù)監(jiān)測、并適用于廣泛生物系統(tǒng)的混合讀取的分析方案非常少。
對單個細胞的可靠識別（細胞圖像分割）是在單細胞水平上量化表型標記物的一項重要任務(wù)。細胞核在所有活細胞中普遍存在，其一致的球形形狀以及多個DNA結(jié)合熒光團的可用性使細胞核成為熒光顯微鏡圖像中染色和隨后分割細胞的理想特征。
由于細胞核在細胞內(nèi)的中心位置，即使是緊密相鄰的細胞也很容易區(qū)分，這為定義具有胞質(zhì)或胞膜定位的標記物的二次檢測區(qū)域提供了基礎(chǔ)。藍色熒光染料（如DAPI，Hoechst染料）是常用的核探針，用于與其他標記目標表型的熒光探針進行多重檢測，包括綠色熒光FITC偶聯(lián)物，紅色熒光TRITC偶聯(lián)物和死細胞染色劑（如碘化丙啶）。
DNA結(jié)合熒光分子的反復暴露和激發(fā)可導致光毒性DNA損傷，阻礙活細胞在較長時間內(nèi)的連續(xù)成像。通常認為光毒性是長時間熒光成像廣泛應(yīng)用的一項關(guān)鍵限制，但高靈敏度熒光顯微鏡的持續(xù)改進為降低核探針的劑量和毒性提供了新的可能性。
本應(yīng)用指南系統(tǒng)地描述了應(yīng)用Spark Cyto進行活細胞的核染色并在重復曝光和連續(xù)熒光成像期間保持最小的細胞毒性的實驗參數(shù)，以及使用Spark Control™和Image Analyzer™軟件進行可靠的自動細胞圖像分割。優(yōu)化的程序用于多重三色實驗，以識別和區(qū)分凋亡性細胞死亡的早期和晚期階段，為動態(tài)長期表型的追蹤奠定了基礎(chǔ)。
材料與方法
細胞培養(yǎng)。人類癌癥細胞株A549、MDA-MB-468和UO-31來自美國國家癌癥研究所（NCI, Bethesda, MD,U S ）。細胞保持在R P M I - 1 6 4 0 細胞培養(yǎng)液中（##21870076，Thermo Fisher Scienti?c），并添加5%透析胎牛血清（#F0392，Sigma Aldrich）， 2 mM 谷氨酰胺（#25030024，Thermo Fisher Scienti?c）和1% 青霉素/鏈霉素溶液（#15140122，Thermo Fisher Scienti?c）。
染料和熒光探針。核染色采用Hoechst 33342（10mg/ml， #H3570，Thermo Fisher Scienti?c）。如下所述稀釋貯存液，并補充到生長細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。在黑暗環(huán)境（37°C，5% CO2）中初始孵育30分鐘后開始成像。Apo Tracker Green （200 nM，Bio Legend）是一種與暴露在細胞表面的磷脂酰絲氨酸（PS）殘基結(jié)合的探針，用于檢測早期凋亡細胞。與能和PS結(jié)合的annexin V相反，Apo Tracker Green的結(jié)合不依賴鈣，可用于低鈣的細胞培養(yǎng)基，如RPMI -1640。用終濃度為0.5 μg/ml的活細胞不滲透的染料碘化丙啶（PI，Sigma Aldrich，#P4864）鑒定細胞膜受損的溶解/壞死和晚期凋亡細胞。
細胞凋亡的藥理誘導。用5 - 氟尿嘧啶（ 5 - F U ，#F6627，Sigma Aldrich）處理貼壁細胞，誘導其生長抑制和凋亡。將粉末溶解在0.1 M NaOH中，無菌過濾后，稀釋在細胞培養(yǎng)基中，獲得50 mM的儲備液。
明場和熒光成像。細胞在低匯合度（20-30%）接種到處理后的96孔細胞培養(yǎng)板（Nunclon™Delta表面處理細胞培養(yǎng)板，#167008，Thermo Scienti?c），并在37°C和5%的CO2中培養(yǎng)過夜使細胞附著。在實驗開始時，將三種熒光探針平行添加到每孔中進行藥物處理。在初始孵育30-45分鐘使核染色平衡后，將孔板插入Spark Cyto進行連續(xù)孵育（37°C，5% CO2）并進行自動熒光成像。使用Spark Control創(chuàng)建一個固定3小時間隔的動態(tài)循環(huán)程序，包括使用多色應(yīng)用程序的進行熒光成像，和使用2X物鏡和匯合度應(yīng)用程序的分析細胞匯合度。在這兩種模式下，使用自動邊界檢測對整個微孔進行成像。
選擇4X物鏡和多色應(yīng)用程序進行熒光成像的實時圖像分析。選擇藍、綠和紅熒光和明場通道，曝光時間分別為，藍色熒光（Hoechst 33342）60 ms，綠色熒光（Apo Tracker Green）150 ms，紅色熒光（PI）200 ms。多色分析的設(shè)置根據(jù)核染色（Hoechst 33342，一級掩膜）和兩項額外的次級掩膜，半徑為 14 m并激活 Voronoi掩模選項。為優(yōu)化綠色和紅色信號的檢測參數(shù)，設(shè)置綠色和紅色熒光強度閾值分別為0.02和0.01RFU。核計數(shù)和每組細胞占比（即藍+/綠+、藍+/紅+或藍+/綠+/紅+）在Spark Control中對每個時間點實時分析，并能以Microsoft Excel®格式導出便于后續(xù)分析和可視化處理。
數(shù)據(jù)分析。圖1-3中的數(shù)據(jù)圖是在Matlab 2018b中生成的。圖3c-f所示的動力學參數(shù)是直接從動態(tài)測量和圖像分析中導出的。對于每個濃度的5-FU，在整個實驗期間（72小時）的所有時間點上觀察到藍色和綠色信號的細胞的最大百分比來確定早期凋亡細胞的最大占比（圖3c）。為了表示晚期凋亡和細胞死亡（圖3d），我們測定了不同劑量5-FU 在72小時出現(xiàn)藍色和紅色信號的細胞比例。凋亡的開始（圖3e）定義為觀察到藍色和綠色信號的細胞比例最大的時間（圖3c）。為了估計細胞凋亡率（圖3f），定義為藍色和綠色信號細胞分數(shù)每小時增加的最大值，將藍色和綠色細胞比例的動態(tài)數(shù)據(jù)分成20個重疊部分，每個部分包含5個數(shù)據(jù)點（15小時），利用Matlab函數(shù)進行線性擬合計算斜率（細胞% / 小時）。圖3f顯示觀察到的20個時間點的最大斜率（凋亡細胞%/小時）。
結(jié)果與討論
優(yōu)化長期活細胞成像的核染色
細胞核是所有活細胞的基本組成部分，明確的功能特征使其成為熒光成像中自動檢測細胞和單個細胞核的理想工具（圖1a）。除了細胞計數(shù)，熒光圖像還可以在單細胞水平上進行多水平表型表征，通過定義二級掩膜，為每個單個細胞分配二級測量細胞表型的報告分子。為了研究這種多色成像試驗中的核染色，我們探索了細胞滲透性藍色熒光染料Hoechst 33342對長期成像的適應(yīng)性，以及多路復用綠色和紅色熒光探針的可能性。
盡管與細胞核DNA選擇性緊密結(jié)合的特征使Hoechst33342成為一種強有力的核染料，但也可能會導致染料分子在細胞核中大量聚集。其在紫外線（UV）光譜范圍內(nèi)被激發(fā)，這加劇了光毒性DNA損傷的風險。因此，本研究旨在尋找在低光毒性條件下有效的核染色實驗條件，通過最小化Hoechst 33342的濃度來減少核染色的風險。
為了確定Hoechst 33342的最佳濃度，在不同濃度對貼壁生長人類癌癥細胞染色，細胞的匯合度（代表細胞活率）和藍色目標計數(shù)連續(xù)監(jiān)測96小時，動態(tài)周期設(shè)置固定時間間隔為2小時。終點分析法常用的檢測的濃度范圍從31ng/ml到1μg/ml，使用確定對細胞活率和細胞圖像分割的影響。我們選擇了三種人類癌癥細胞株，A549肺癌、MDA-MB-468乳腺癌和UO-31腎癌，來評估潛在的細胞類型特異的靈敏度和成像特性。
細胞匯合度數(shù)據(jù)顯示，在存在Hoechst 33342時所有三種類型細胞的生長均受到強烈的濃度依賴性抑制。這出現(xiàn)在最初的24小時（圖1b），與之前報道的長期活細胞成像中的光毒性一致。雖然Hoechst 33342濃度的降低能解決對所有三個細胞系在細胞生長上的負面影響，但一個關(guān)鍵問題是，如此低的濃度是否仍然可以進行細胞核圖像分割。
為了取得細胞核分割和毒性之間的最佳平衡，在長期孵育期間，系統(tǒng)地比較了不同濃度Hoechst 33342下動態(tài)增加的細胞數(shù)量（圖1c），這由細胞匯合度和藍色目標計數(shù)決定。在最佳染色條件下，預期細胞匯合度和藍色目標計數(shù)的相對增加是一致的，并且與未染色培養(yǎng)組中細胞匯合度的動態(tài)增加相匹配。然而在所有的細胞系里使用非常低和非常高濃度的未染色對照中觀察到大的偏離， 同時發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-468細胞和UO-31細胞中62.5和125ng/ml濃度的Hoechst 33342導致藍色目標計數(shù)（圖1c中第2和3行）與細胞匯合度數(shù)據(jù)一致。這表明能實現(xiàn)符合要求的細胞核分割。
對A549細胞，濃度稍高是最合適的，250ng/ml的濃度對生長沒有負面影響，核計數(shù)直到培養(yǎng)達到完全匯合（大約48小時）都是可靠的（圖1c中第1行）。A549中低劑量的Hoechst 33342縮短了藍色目標計數(shù)充分反映細胞匯合度數(shù)據(jù)的時間窗口。這表明可能會由于熒光強度低，對細胞核的識別不完全。
形態(tài)上的差異（圖1d）可能是由于不同細胞類型特異性最佳濃度略有不同。球形MDA-MB468細胞的細胞核區(qū)較密集，需要較低的濃度就能達到可靠分割的信號閾值。相比之下，A549細胞形狀扁平，意味著核體積分布在更大的區(qū)域，這降低了像素強度，可能導致核分割的靈敏度相對較低。
總的來說，結(jié)果表明在不影響分割質(zhì)量的情況下，Hoechst 33342濃度降低8倍是可能的。與傳統(tǒng)染色方案相比，有機會解決光毒性問題。
(a) 細胞核的熒光標記允許使用細胞圖像分割分法在熒光圖像中定位單個細胞。
(b) 在增加DNA結(jié)合核染料Hoechst 33342濃度的情況下，三種不同癌細胞系的細胞匯合度的動態(tài)監(jiān)測。圖像由Spark Cyto在4倍放大倍數(shù)下獲取，并使用匯合度應(yīng)用程序?qū)崟r分析細胞的匯合度（細胞所覆蓋的微孔面積百分比）。(c) 根據(jù)細胞匯合度（黑色線條）和藍色目標計數(shù)數(shù)據(jù)（核計數(shù)，藍色線條）以及在未染色細胞培養(yǎng)中測量的細胞匯合度（空心黑色線條）重建的生長動態(tài)。
(d) A549、MDA-MB-468和UO-31細胞用125 ng/mL的Hoechst 33342染色后的明場和藍色熒光圖像，顯示了不同的形態(tài)和細胞核區(qū)域。所有圖像都是在Spark Cyto中以4倍放大倍數(shù)獲取。為了便于觀察，增強了藍色熒光圖像中的對比度。
三色分析法在原位貼壁細胞培養(yǎng)中檢測早期凋亡
Spark Cyto采用三色熒光成像方法原位檢測凋亡細胞，結(jié)合使用優(yōu)化后的核染色步驟和二級標記物。細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種形式，是一種與健康和疾病密切相關(guān)的標志性細胞表型。凋亡性細胞死亡是發(fā)育的組成部分，包括組織穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，也具有阻止疾病進展的有利藥理作用。
存在不同的熒光探針來檢測已經(jīng)在早期階段（1，2）誘導的細胞凋亡，包括結(jié)合外源磷脂酰絲氨酸（PS）殘基的熒光團偶聯(lián)蛋白，例如膜聯(lián)蛋白annexins。由于探針接近靶標不需要膜滲透，因此該方法只需通過簡單地將探針添加到細胞培養(yǎng)基中來原位標記活細胞。
最常用的膜聯(lián)蛋白（annexin V）需要鈣離子的存在才能有效結(jié)合PS， 本研究選擇了Apo Tracker™Green（Biolegend）。這種最近開發(fā)的探針可以不依賴Ca2+結(jié)合（3），并能在低鈣的環(huán)境和培養(yǎng)基（例如RPMI-1640）中檢測PS易位。為了區(qū)分凋亡和壞死細胞的死亡機制（圖2a），碘化丙啶作為細胞不滲透的熒光探針，僅在膜完整性受損時與細胞DNA結(jié)合，表明細胞溶解和死亡。膜完整性的喪失也發(fā)生在凋亡的后期，導致Apo Tracker Green和碘化丙啶同時標記的細胞出現(xiàn)。
該方法無需額外的樣品操作就能檢測細胞藥理學凋亡。A549肺癌細胞用500 μM 5-FU處理，然后加入Hoechst33342、Apo Tracker Green和碘化丙啶，在Spark Cyto的受控環(huán)境（37°C, 5% CO2）中孵育，42小時后得到明場和熒光圖像（圖2b-c）。使用Spark Control中的多色應(yīng)用程序，根據(jù)二級標記自動對Hoechst 33342陽性細胞進行多色分類：
(a)實驗原理概述。用低濃度Hoechst 33342染色活細胞的細胞核，在藍色熒光圖像中分割細胞核。在細胞核周圍一定半徑處定義二級分割掩模（黃色圓圈）用于測定二級標記物。使用Spark Control中的多色應(yīng)用程序，自動將染色細胞分類為活細胞（僅標記核）、早期凋亡細胞（Apo Tracker Green+）、晚期凋亡細胞（Apo Tracker Green+/碘化丙啶+）或溶解細胞（碘化丙啶+）。用5-FU處理A549肺癌細胞(b)的凋亡與未處理的對照組(c)比較。在Spark Cyto中用4倍放大獲取明場、藍色、綠色和紅色熒光圖像。
• 活細胞（無二次染色）；
• 早期凋亡細胞（Apo Tracker Green+）；
• 晚期凋亡細胞 （Apo Tracker Green+ 和碘化丙啶+）；
• 溶解細胞/壞死細胞（碘化丙啶+）。
在5-FU處理的細胞（13,179±636藍色目標）和對照組（5,927±191藍色目標）之間觀察到細胞核數(shù)量的巨大差異，這與細胞匯合度（分別為46±2%和71±5%）的巨大差異一致。在5 - F U 處理的細胞培養(yǎng)中， 早期凋亡細胞（Apo Tracker Green+）的比例也顯著升高，占所有檢測到的細胞核的20±1%，而在未處理的對照組中為0.7±0.6%。
此外，在加入5-FU 的42小時后，可以看到一小部分處于凋亡晚期階段的細胞（Apo Tracker Green+/ 碘化丙啶+），占細胞總數(shù)的28±1%，而在未處理對照組中則不到1%。在5-FU處理的培養(yǎng)物中，僅碘化丙啶染色的溶解細胞很少見，而在未處理的培養(yǎng)物中則不存在（分別為3±0%和0±0%）?？傊?，結(jié)果表明三色分析法能準確檢測和區(qū)分活細胞培養(yǎng)中的早期和晚期凋亡。
全自動實時監(jiān)測細胞凋亡誘導
優(yōu)化后的三色分析法用于動態(tài)監(jiān)測5-FU劑量依賴性誘導的細胞凋亡。A549肺癌細胞在96孔板3復孔用增加劑量的5-FU處理后，在Spark Cyto中72小時監(jiān)測活細胞、早期和晚期凋亡細胞以及壞死細胞的比例和細胞匯合度。為了動態(tài)進行熒光成像和多色分析，Spark Control里設(shè)計固定3小時間隔的動態(tài)循環(huán)程序，以獲取明場、藍色、綠色和紅色熒光圖像并進行實時圖像分析。
PS殘基從細胞膜的內(nèi)表面易位到外表面是細胞誘導凋亡后的早期事件，發(fā)生在細胞膜完整性喪失之前，因此Apo Tracker Green染色被認為先于碘化丙啶染色。隨著凋亡性細胞死亡的發(fā)展，細胞經(jīng)歷膜完整性的喪失，導致出現(xiàn)一批晚期凋亡細胞，這些細胞同時表現(xiàn)Apo Tracker Green和碘化丙啶染色。細胞匯合度分析顯示，濃度低至5μM的5-FU處理時可導致強烈的生長抑制，而在濃度高于250μM時，隨著時間的推移，可以觀察到細胞匯合度明顯減少（圖3a），可能表示細胞萎縮和脫離。熒光成像和多色分析證實隨著5-FU濃度的增加，其毒性逐漸加重。當濃度低于100μM時，生長抑制占主導，細胞死亡很少，早期凋亡迅速增加，ApoTracker Green+細胞在高劑量5-FU時大約24小時開始出現(xiàn)（圖3b）。在早期凋亡細胞出現(xiàn)這個早期高峰后，ApoTracker Green+/ 碘化丙啶+晚期凋亡細胞急劇增加（圖3b），這與細胞凋亡的快速發(fā)展相一致。
總的來說，動力學數(shù)據(jù)證明了凋亡誘導過程中預期的事件過程，同時揭示了5-FU促凋亡作用的強劑量效應(yīng)關(guān)系。加上早期凋亡細胞的最大百分比和晚期凋亡/死亡細胞的最大百分比（分別為圖3c和3d），誘導凋亡的時間和速率也強烈依賴于5-FU的濃度（圖3e-f）。在預定義的終點測量往往只能提供一個瞬時快照，而動力學數(shù)據(jù)允許查看細胞凋亡誘導過程的任何動力學參數(shù)。
(a-b) A549細胞使用不同劑量的5-FU處理，并加入Hoechst 33342、ApoTracker Green和碘化丙啶。在Spark Cyto中使用動態(tài)循環(huán)程序（間隔3小時）和匯合度程序和多色應(yīng)用程序進行72小時的細胞匯合度（圖a）和凋亡誘導（圖b）的動態(tài)監(jiān)測。
(c-f) 誘導凋亡的動力學參數(shù)呈濃度依賴性關(guān)系，包括早期凋亡細胞的最大百分比（圖c），72小時后晚期凋亡細胞和死亡細胞的百分比（圖d），早期凋亡的發(fā)生，即早期凋亡細胞分數(shù)達到最大值的時間（圖e），以及早期凋亡率，即描述早期凋亡細胞增加的最高斜率（早期凋亡細胞每小時百分比，圖f）。所有參數(shù)均來自圖b中的動態(tài)數(shù)據(jù)。
結(jié)論
動態(tài)跟蹤細胞表型和生理學改變的方法為基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中的細胞群的詳細功能表征鋪平了道路。雖然破壞性和勞動密集型實驗方式，主要基于流式細胞術(shù)測量，迄今為止限制了表型測量的可擴展性和通量，但活細胞成像技術(shù)的最新發(fā)展重新點燃了開發(fā)動態(tài)和長期成像和表型跟蹤實驗程序的動力。本應(yīng)用指南描述了通過使用低濃度的常見核染料Hoechst 33342來解決光毒性問題的優(yōu)化細胞核染色系統(tǒng)性方案。Spark Cyto中強大的全孔熒光成像技術(shù)，結(jié)合Spark Control和Image Analyzer中靈敏的分割算法，允許將這種染色方案用于長期活細胞成像，以及與其他熒光探針進行多重檢測，以評估復雜的細胞表型，如細胞凋亡。
Spark Control可實施定時自動明場和熒光成像，無需用戶干預，多色應(yīng)用程序可實時定量顯示不同表型的細胞百分比，具有出色的重復性?？傮w而言，Spark Cyto為細胞表型的動態(tài)跟蹤提供了一個理想的平臺，并在預定的終點提供細胞表型的動態(tài)數(shù)據(jù)編碼機制的相關(guān)信息，而不僅僅是靜態(tài)快照。
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（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654414933828620288） | 
