簡(jiǎn)介
科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到很多因素的影響。因此，為了獲得可靠且重現(xiàn)性高的結(jié)果，必須設(shè)定并提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件，包括溫度等環(huán)境因素。眾所周知，根據(jù)范特霍夫方程的描述，化學(xué)反應(yīng)速率的改變高度依賴溫度的變化。然而，世界各地實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度會(huì)因當(dāng)?shù)貧夂?、季?jié)、甚至是在同一天的不同時(shí)間都存在很大差別（圖1）。
多功能酶標(biāo)儀是終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的常用工具，但酶標(biāo)儀檢測(cè)室內(nèi)的溫度不一定與室溫相同。由于儀器內(nèi)部的電子設(shè)備發(fā)熱，可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)室內(nèi)的溫度高于環(huán)境溫度4°C，特別是長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行的酶標(biāo)儀。
迄今為止，唯一可行的是使用溫度控制模塊來加熱多功能酶標(biāo)儀，而不是將溫度設(shè)定成室溫或更低溫度。這一做法可能會(huì)導(dǎo)致溫度敏感性實(shí)驗(yàn)（如酶學(xué)分析）出現(xiàn)問題，隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性會(huì)受到很大影響。此外，在檢測(cè)過程中即使短短幾分鐘的溫度上升也會(huì)降低實(shí)驗(yàn)的精確度。
作為Tecan首款擁有Te-Cool 制冷模塊的Spark多功能酶標(biāo)儀，能夠很好地解決這一問題。這套溫控系統(tǒng)可以冷卻檢測(cè)室，用戶可將溫度設(shè)定在18-42°C之間，從而確保無論何時(shí)何地都能獲得穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件。
材料與方法
在酶學(xué)實(shí)驗(yàn)中，螢光信號(hào)強(qiáng)度隨溫度發(fā)生改變
通過螢光素酶實(shí)驗(yàn)來評(píng)估酶的溫度依賴性。將超純的ADP添加到含有螢光素酶的反應(yīng)緩沖液中。將20μl反應(yīng)混合物加樣到384孔板的邊緣和中心孔中（見圖2微孔板布局），剩余的孔加水。
微孔板在常溫（22°C）下放置至少10分鐘以上，在多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定不同溫度（18、22°C（室溫）、26°C和30°C）下的發(fā)光信號(hào)，并進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)10分鐘的終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（表1）。
酶學(xué)穩(wěn)定性取決于溫度的變化
酶分析實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是酶活穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證升溫會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，我們進(jìn)行了一次連續(xù)的螢光素酶測(cè)定，對(duì)純化的海腎螢光素酶和螢火蟲螢光素酶進(jìn)行了檢測(cè)。將螢光素酶加樣到96孔板中。微孔板放置在Spark酶標(biāo)儀上，設(shè)置不同的溫度（18°C、22°C（室溫）、26°C和30°C），在加入100 μl相應(yīng)底物后，連續(xù)10秒檢測(cè)每種螢光素酶發(fā)出的信號(hào)（表2）。
結(jié)果
在酶學(xué)實(shí)驗(yàn)中，生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度隨溫度發(fā)生改變
酶促反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率通常取決于溫度的改變，溫度升高反應(yīng)速率會(huì)增加。在一個(gè)典型的發(fā)光激酶試驗(yàn)中，我們?cè)跈z測(cè)不同溫度下螢光素酶活性的變化中，發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象（圖3）。溫度每升高1°C，發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)約10%。
在動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，當(dāng)酶標(biāo)儀平衡至室溫時(shí)，室溫下的微孔板中的發(fā)光信號(hào)是恒定的（圖4A）。與初始值相比，當(dāng)酶標(biāo)儀內(nèi)的溫度升高，微孔板會(huì)被加熱，從而產(chǎn)生更高的發(fā)光信號(hào)。在僅6分鐘的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)（該時(shí)間內(nèi)可完成384孔板的檢測(cè)），在高于室溫4°C時(shí)發(fā)光信號(hào)增加了34%；在高于室溫8°C時(shí)增加了78%；酶標(biāo)儀在室溫條件下操作，信號(hào)強(qiáng)度降低了2%。此外，在較高的溫度下檢測(cè)，結(jié)果的變異系數(shù)（CV值）顯著增加（圖4B）。
圖 4：動(dòng)力學(xué)檢測(cè)中隨時(shí)間變化的生物發(fā)光信號(hào)。在6分鐘的測(cè)量時(shí)間內(nèi)，由于孔內(nèi)液體被加熱，生物發(fā)光信號(hào)增加（A）。信號(hào)變化增大，測(cè)量結(jié)果的CV增大（B）。
酶學(xué)穩(wěn)定性取決于溫度的變化
實(shí)驗(yàn)溫度的變化并非像我們預(yù)想的那樣會(huì)影響酶的活性。一些酶在不同溫度下的轉(zhuǎn)化率可能會(huì)改變，而另一些酶的穩(wěn)定性則會(huì)降低。針對(duì)螢火蟲和海腎螢光素酶進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)，將酶標(biāo)儀置于不同的實(shí)驗(yàn)溫度下，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了該推論。該實(shí)驗(yàn)方法需要相對(duì)較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，導(dǎo)致每個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間約為30秒，整個(gè)96孔板大約需要45分鐘。圖5顯示螢火蟲螢光素酶的生物發(fā)光信號(hào)隨著時(shí)間的推移而減少，這是由于蛋白質(zhì)在高溫下，尤其是在30°C下具有不穩(wěn)定性（A）。相比之下，海腎螢光素酶沒有受Spark酶標(biāo)儀內(nèi)溫度的影響（B）。比較多個(gè)微孔板孔的CV值，溫度對(duì)酶活性的影響變得很明顯（圖6）。
結(jié)論
本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，溫度通常是化學(xué)反應(yīng)的一個(gè)重要參數(shù)，尤其是針對(duì)酶分析實(shí)驗(yàn)。本次研究使用三種不同的酶，作為酶活性潛在依賴于溫度的樣例。三種酶中有兩種由于受到溫度變化的強(qiáng)烈影響，導(dǎo)致活性改變或穩(wěn)定性降低。因此，為了獲得最佳的數(shù)據(jù)質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)過程中控制溫度參數(shù)至關(guān)重要。
Spark多功能酶標(biāo)儀的Te-Cool溫度控制模塊不僅可以加熱酶標(biāo)儀，而且可以制冷，甚至可以低于室溫。該功能不僅可以滿足實(shí)驗(yàn)所需的精確檢測(cè)條件，還可以通過增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果的可重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性來提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。無論何時(shí)何地，這個(gè)獨(dú)特的制冷模塊都可以幫助用戶獲得最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
參考文獻(xiàn)
1) Atkins, Peter; De Paula, Julio (10 March 2006).Physical Chemistry (8th ed.). W.H. Freeman and Company. p. 212. ISBN 0-7167-8759-8
| 
