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| Western Blot一做就是一天半，有個方法幫你 3 小時搞定 |
| [ 發(fā)布日期：2023-5-8 13:36:16 閱讀次數(shù)：552 ] |
Western Blot（WB）被稱為科研人心中的「噩夢」實驗，為什么這么說呢？首先，WB操作步驟繁雜，實驗流程長。從蛋白提取、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育到成像，每個流程都相當耗時。特別是抗體孵育，還需要過夜。其次，WB實驗結果受太多人為因素的影響。比如，制膠拔梳子太快，膠被弄裂；轉(zhuǎn)膜「三明治」疊放順序出錯，導致轉(zhuǎn)膜失敗......最讓人煩惱的一點，WB實驗的重復性和穩(wěn)定性不佳。學術新聞里常常能看到SCI 文章由于WB實驗無法重復而撤稿。望著我的實驗記錄本，滿滿的失敗數(shù)據(jù)和注意事項。眼看著離心管里來之不易的蛋白樣本就要見底，難道真的沒有更簡單更可靠的WB實驗方法了嗎？科研人員為了簡化WB實驗的流程，一直在對其進行優(yōu)化。近年，興起了一種新的蛋白檢測技術--全自動蛋白質(zhì)表達定量分析（Automatic Quantitative Protein Analysis）。它將傳統(tǒng) WB 的制膠、蛋白電泳分離、雜交和成像集成到一個系統(tǒng)中，并實現(xiàn)全自動化。它因為步驟簡單，也被叫做全自動毛細管Digital Western系統(tǒng)（也稱Simple Western）。Digital Western一經(jīng)問世，便深受科研人的喜愛，它不光節(jié)省樣本，而且大大節(jié)省了操作時間，它精確的數(shù)據(jù)分析能力幫助科研人得到更準確的實驗結果。頂級雜志Neuron（五年平均 IF = 18.65）2019 年發(fā)表的一篇文章中, Digital Western被用于微量中腦組織和原代神經(jīng)元細胞蛋白質(zhì)表達分析。作者僅用了 0.2μg總蛋白就得到實驗結果，這只是傳統(tǒng)WB所需蛋白量的幾十分之一。Nature Communications（五年平均IF = 15.81）發(fā)表了一篇有關腫瘤細胞信號通路研究的論文，也用了Digital Western 系統(tǒng)來檢測蛋白。在該系統(tǒng)中，所用抗體在正確的波段顯示后才被正式使用到實驗里。通過該系統(tǒng)自動化的數(shù)據(jù)分析，實驗者對蛋白進行了有效定量，確定了每個樣本中目標蛋白的絕對值，使實驗結果更可信，更精準。圖片來源：Nature Communications這些證據(jù)也許還不足以證明Digital Western的優(yōu)勢，我們不免還是抱有懷疑：Digital Western真的有這么厲害嗎？為此，有研究人員專門對比了Digital Western 系統(tǒng)和傳統(tǒng) WB 兩種蛋白定量分析方法的靈敏度、重復性和適用范圍[3]。結果表明相比于傳統(tǒng) WB ：? Digital Western 無需制膠、無需轉(zhuǎn)膜，安全環(huán)保? 3 小時左右獲得結果，縮短實驗優(yōu)化時間? 可以檢測低至 0.5 μg 左右的蛋白量，對于來源不易的樣本，更節(jié)省樣品當目標蛋白分子量差異較大時，可以用Digital Western系統(tǒng)同時檢測目標分子和內(nèi)參。圖注：采用Digital Western同時檢測兩種蛋白。(A) 同時檢測內(nèi)參（GAPDH 或 Actin）和目的蛋白Ku70的泳道圖；(B) 同時檢測GAPDH和目的蛋白 Ku70 的峰形圖；(C) 同時檢測Actin和目的蛋白Ku70的峰形圖。其實，國內(nèi)外目前已經(jīng)有許多高分文獻應用 Digital Western 技術檢測蛋白，WB 正在經(jīng)歷著前所未有的技術革新。StellarTM 超靈敏熒光檢測試劑盒，搭載在全自動多功能超靈敏熒光Western蛋白質(zhì)分析平臺Jess上（Digital Western），能為科研人提供自動化高靈敏熒光免疫蛋白檢測技術解決方案。優(yōu)勢如下：圖注：ProteinSimple超靈敏熒光檢測試劑盒 StellarTM圖注：Stellar NIR和IR熒光多重檢測的AKT總/磷蛋白。StellarTM NIR / IR通道能夠在同一泳道中多重檢測總AKT和磷酸化AKT，并具有出色的重現(xiàn)性（24個泳道: pAKT < 10% CVs和Total AKT < 5% CVs）。圖注：StellarTM 熒光檢測的靈敏度通過DNA與檢測抗體相連的多個信號放大步驟實現(xiàn)。? 簡單高效對細胞信號通路研究中磷酸化蛋白進行檢測? 全程追蹤記錄，原始數(shù)據(jù)不可纂改，解決傳統(tǒng) WB 圖片誤用造假問題? 總蛋白質(zhì)含量歸一化分析，可以比較蛋白質(zhì)上樣量? 與對照樣品歸一化處理，比使用內(nèi)參蛋白更可靠，增加數(shù)據(jù)說服力[1]. Back S., Necarsulme J., Whitaker L.R., et al., Neuron-Specifific Genome Modifification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats. Neuron , 2019, 102: 105–119.[2]. Ilyas Chachoua, Ilias Tzelepis, Hao Dai, et al., Canonical WNT signaling-dependent gating of MYC requires a noncanonical CTCF function at a distal binding site. NATURE COMMUNICATIONS, 2022,13: 204.[3]. 雷虹, 胡峰瑞, 陳妍珂, 茍興春. 蛋白免疫印跡和全自動蛋白質(zhì)定量分析的比較研究[J]. 生物醫(yī)學, 2021, 11(2): 113-119.
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