盡管近年來分子醫(yī)學(xué)的實(shí)踐已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步——反義寡核苷酸(ASO)療法的批準(zhǔn)以及第一個(gè)基于CRISPR的療法證明了這一點(diǎn)——神經(jīng)退行性疾病，如朊病毒病、亨廷頓病、阿爾茨海默病和帕金森病，仍然是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。毒性蛋白聚集與神經(jīng)變性有關(guān)，這表明基因沉默是一種廣泛適用的治療策略。盡管ASOs和基于CRISPR的沉默提供了抑制致病蛋白表達(dá)的潛力，但尚未取得成功。
ASOs通過結(jié)合靶mRNA并誘導(dǎo)其降解、剪接修飾和其他改變其翻譯可用性的修飾來損害蛋白質(zhì)合成。雖然臨床前療效已被證明與ASO治療。對(duì)于小鼠模型中的朊病毒疾病。到目前為止，在臨床上的成功要么是缺乏的，要么是有限的。ASOs也有很大的技術(shù)限制，包括其短期療效需要反復(fù)鞘內(nèi)注射(進(jìn)入椎管)和藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，如腦積水、腦膜炎和肝毒性?；贑RISPR的沉默技術(shù)提供了另一種方法，將催化死亡的Cas蛋白拴在效應(yīng)域上。最初的“表觀遺傳編輯”嘗試使用的抑制因子結(jié)構(gòu)域被證明只能使基因短暫沉默。
CRISPRoff是最近開發(fā)的一種表觀遺傳編輯器，它含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，可以通過啟動(dòng)子的定點(diǎn)甲基化實(shí)現(xiàn)更持久的基因沉默。盡管取得了這些進(jìn)展，但仍然存在一些重要的局限性:腺相關(guān)病毒(AAV)載體仍然是將轉(zhuǎn)基因傳遞到大腦的主要手段。CRISPRoff太大，無法裝入單個(gè)AAV載體；AAV載體促進(jìn)長期編輯表達(dá)，帶來有害免疫反應(yīng)和脫靶編輯的風(fēng)險(xiǎn)，組構(gòu)活性效應(yīng)酶的束縛可導(dǎo)致無節(jié)制的脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性。
甲基轉(zhuǎn)移酶(CHARM)是一種緊湊、無酶的表觀遺傳編輯器，可以招募內(nèi)源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，誘導(dǎo)靶基因啟動(dòng)子的超甲基化，并在通過單個(gè)AAV載體遞送小鼠大腦后持久地沉默基因的表達(dá)，從而使其蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生。這種創(chuàng)新的方法解決了現(xiàn)有編輯方法的每個(gè)限制。
基于CRISPR的編輯工具由于其復(fù)雜性和大小而具有挑戰(zhàn)性。盡管含有mRNA的脂質(zhì)納米顆?？梢杂行У貙⒋笮途庉嬈鬟f送到肝。目前它們瞄準(zhǔn)其他器官(如大腦)的能力有限。為了實(shí)現(xiàn)高效的非肝臟遞送，需要多種AAV載體來容納大尺寸的表觀基因組編輯器，如CRISPRoff。但這種策略意味著降低效力，增加AAV劑量來補(bǔ)償，從而增加毒性。
通過擺脫CRISPR的使用，并創(chuàng)建一個(gè)模塊化的基于鋅指的“ZFPoff”表觀基因組編輯器，它不需要大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域——鋅指DNA結(jié)合基序比Cas蛋白小得多。
使用系縛酶可以增加編輯效力，但可能產(chǎn)生不良后果。一個(gè)公認(rèn)的例子是由CRISPR堿基編輯器進(jìn)行的不依賴于引導(dǎo)RNA的脫靶編輯，其中束縛的脫氨酶結(jié)構(gòu)域可以隨機(jī)改變整個(gè)基因組和轉(zhuǎn)錄組中的DNA和RNA序列。證實(shí)細(xì)胞毒性是CRISPRoff中使用的組成活性甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[D3A，源自哺乳動(dòng)物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A (DNMT3A)蛋白]的問題，特別是在ZFPoff中與鋅指一起使用時(shí)。
根據(jù)DNMT3A調(diào)節(jié)的自然機(jī)制，從編輯器中移除D3A結(jié)構(gòu)域，并使用非酶促DNMT3L c末端結(jié)構(gòu)域(D3L)和組蛋白H3尾部的融合，它們一起將內(nèi)源性和非活性DNMT3A特異性地招募到目標(biāo)基因組位點(diǎn)并原位激活它，從而避免任何普遍的細(xì)胞毒性。D3L-H3尾部融合是相當(dāng)小的，這意味著多達(dá)三個(gè)正交的表觀遺傳編輯器(針對(duì)不同的基因組區(qū)域)可以通過一些涉及分裂內(nèi)鏈的巧妙工程融入一個(gè)AAV載體。
Neumann等人通過展示編輯工具長期表達(dá)可能帶來的潛在不良影響的自我沉默能力，克服了這些擔(dān)憂。他們讓其中一個(gè)編輯器靶向AAV載體中的啟動(dòng)子，從而關(guān)閉所有編輯器的表達(dá)。CHARMs可以被編程來調(diào)節(jié)這種自我沉默，以優(yōu)化治療性基因沉默和編輯器表達(dá)的短暫性之間的平衡。另一個(gè)安全優(yōu)勢是CHARMs缺乏細(xì)菌表位（與基于CRISPR的工具不同），因此它們的免疫原性可能比其他表觀遺傳編輯器更有利。
在體內(nèi)對(duì)PrP蛋白應(yīng)用CHARM介導(dǎo)的表觀遺傳編輯時(shí)，確立了其有效性和持久性。AAV傳遞的CHARMs——包括自我沉默的CHARMs——靶向Prnp啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了大腦中Prnp轉(zhuǎn)錄本和PrP蛋白水平的廣泛降低，并在治療后長達(dá)13周的時(shí)間內(nèi)Prnp啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化。基于先前的工作，預(yù)計(jì)這種效果將延長朊病毒病小鼠模型的生存期，也許對(duì)人類患者也是如此。
隨著CHARMs的發(fā)展，Neumann等人引入了一種強(qiáng)大且安全的基因沉默編輯技術(shù)，通過AAV傳遞到通常難以靶向的器官，如大腦。限制包括對(duì)通過甲基化對(duì)PRNP和其他疾病位點(diǎn)進(jìn)行基因沉默的長期持久性的不確定性，這尚未得到保證，需要逐案確定。需要克服的額外挑戰(zhàn)是，基因沉默可能僅對(duì)某些疾病有用，并且鋅指引發(fā)的非目標(biāo)編輯的潛力比CRISPR基工具定義得不那么明確。盡管如此，類似于CHARMs的表觀遺傳編輯器最終可能被證明對(duì)人類健康的影響與其他變革性技術(shù)一樣深遠(yuǎn)，如堿基編輯和先導(dǎo)編輯。
An epigenetic editor to silence genes
（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/20240628100931013.htm） | 
