在新一代測序（NGS）中，許多文庫制備方法都需要用到PCR擴增。盡管許多PCR酶能高效、準確且特異地擴增單個靶點，但很少有酶是專為NGS設計的，能夠無偏倚地擴增不同大小和GC含量的靶點。
為此，Wellcome Sanger研究所的研究人員近日對20多種高保真PCR酶進行測評，以選擇最適合短讀長測序和長讀長測序應用的PCR聚合酶和產品。這項成果發(fā)表在《Microbial Genomics》雜志上。
在測試的20多種酶中，他們發(fā)現(xiàn)Quantabio公司的RepliQa HiFi ToughMix、Watchmaker公司的Equinox Amplification Master Mix以及Takara公司的Ex Premier DNA聚合酶是擴增短讀長文庫的“首選酶”。同時，Quantabio公司的RepliQa HiFi ToughMix也在長讀長文庫擴增競賽中脫穎而出。
Wellcome Sanger研究所負責測序研發(fā)的首席科學家Michael Quail領導了這項工作。他的研究團隊曾在十年前評測了在短讀長Illumina文庫擴增中表現(xiàn)最佳的酶。他們當時選出了Roche公司的Kapa HiFi DNA聚合酶，并將結果發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。
Quail表示：“在過去的十年中，各家公司都開發(fā)出了新的PCR酶。我們想用一些新產品來重復這項研究。”
在這項新研究中，研究人員比較了20多種市售的高保真PCR酶產品，它們來自眾多的NGS樣本制備試劑供應商，包括Roche、Takara、Thermo Fisher Scientific、Agilent Technologies、New England Biolabs、Bio-Rad Laboratories和QIAGEN等。
為了對短讀長擴增的各種酶進行基準測試，研究人員以四種GC含量不同的微生物基因組作為PCR模板來制備Illumina測序文庫，它們分別是：百日咳桿菌、大腸桿菌、艱難梭菌和惡性瘧原蟲。
對于測試的每種酶，他們使用制造商建議的變性和延伸時間，以1 ng文庫片段為模板進行14個循環(huán)的擴增。他們發(fā)現(xiàn)Quantabio RepliQa、Kapa HiFi、Invitrogen Platinum SuperFi II、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier等酶的產量較高。
同時，Quantabio RepliQa、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier對所有的基因組都表現(xiàn)出很好的覆蓋均一性。此外，這三種酶擴增后檢測SNP和插入缺失時的靈敏度最高。
在長讀長測序的文庫制備過程中，長距離PCR通常更有挑戰(zhàn)性，因為產量較低，而且擴增過程偏向于較小的片段。為了測試PCR酶在這種應用中的適用性，研究人員制備了21.6 kb和13.3 kb的酵母DNA片段，并在添加Illumina接頭后作為模板。
他們發(fā)現(xiàn)，Quantabio RepliQa和Takara Terra聚合酶帶來了最長的插入片段，約為12 kb。不過作為Taq的衍生物，Terra的錯誤率較高。在將測序文庫用于PacBio測序時，RepliQa和Terra聚合酶也給出了最連續(xù)的組裝結果。
研究人員認為，不同PCR酶在擴增片段的產量和均一性方面存在明顯差異。他們認為Quantabio RepliQa、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier可擴增極端的GC含量，其覆蓋偏倚與PCR-free數(shù)據(jù)相似。
“令人驚訝的是，不同酶之間的產量差異很大，這再次說明用戶應當精心挑選PCR酶，因為使用低效的酶可能會導致產量偏低，因此用戶需要采用更多的PCR循環(huán)，從而使偏倚更嚴重，”作者寫道。
(文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/2024619142634191.htm) | 
