內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸?shù)闹匾?xì)胞器。ER中的蛋白質(zhì)折疊壓力，可能導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累，即"ER應(yīng)激"。這一情況會(huì)激活未折疊蛋白響應(yīng)（UPR），這是由三個(gè)ER跨膜蛋白（IRE1α、PERK和ATF6）啟動(dòng)的信號(hào)通路。然而，近年來(lái)的研究表明，UPR的激活并不總是由于ER應(yīng)激引起，UPR也可能在沒(méi)有ER應(yīng)激的情況下被激活。解碼ER應(yīng)激與UPR之間復(fù)雜的關(guān)系，對(duì)于理解細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下的應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要。
2024年6月11日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的王立堃團(tuán)隊(duì)在《Cell Reports》雜志上在線發(fā)表了題為"Deciphering ER stress-unfolded protein response relationship by visualizing unfolded proteins in the ER"的研究論文。該研究開(kāi)發(fā)了一種新型的熒光報(bào)告系統(tǒng)，能夠在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)可視化ER腔內(nèi)未折疊蛋白的積累。通過(guò)這一系統(tǒng)，研究人員能夠更好地理解ER stress與UPR之間的復(fù)雜關(guān)系，從而揭示在多種生理和病理?xiàng)l件下ER蛋白穩(wěn)態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。
團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種熒光報(bào)告系統(tǒng)，將ER應(yīng)激信號(hào)傳遞蛋白PERK的ER腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域（PERK(LD)）與綠色熒光蛋白（EGFP）和趨向形成六聚體的肽段（HOTag）融合表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)檢測(cè)ER腔內(nèi)未折疊蛋白積累。研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ER內(nèi)的未折疊蛋白積累時(shí)，PERK(LD)會(huì)發(fā)生二聚化，帶動(dòng)EGFP和HOTag形成明顯的熒光斑點(diǎn)。這一系統(tǒng)在HeLa和COS-7細(xì)胞中表現(xiàn)出高度的靈敏性和可逆性，能夠?qū)崟r(shí)反映ER應(yīng)激和UPR的動(dòng)態(tài)變化。課題組進(jìn)一步應(yīng)用這一系統(tǒng)，檢測(cè)在不同應(yīng)激條件下ER中的蛋白質(zhì)狀態(tài)。例如，他們?cè)谀M腫瘤微環(huán)境的低氧和酸性條件下，觀察到了未折疊蛋白的積累。他們還發(fā)現(xiàn)，盡管已有的研究表明棕櫚酸能以不依賴ER應(yīng)激的方式觸發(fā)UPR，但棕櫚酸實(shí)際上仍會(huì)導(dǎo)致ER腔內(nèi)未折疊蛋白的積累，這表明脂質(zhì)雙層應(yīng)激與ER蛋白穩(wěn)態(tài)的紊亂是交織在一起的。
為了證明熒光報(bào)告系統(tǒng)確實(shí)是由未折疊蛋白聚集引起，研究團(tuán)隊(duì)使用了多種技術(shù)手段，包括共定位實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀，驗(yàn)證了熒光報(bào)告系統(tǒng)與未折疊蛋白之間的直接結(jié)合。他們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過(guò)表達(dá)的PERK(LD)-EGFP-HOTag3與NHK（null Hong Kong mutant alpha 1 anti-trypsin，一個(gè)經(jīng)典的ER定位的錯(cuò)誤折疊蛋白）共表達(dá)時(shí)，能夠形成顯著的熒光斑點(diǎn)，進(jìn)一步證明了該系統(tǒng)的特異性和敏感性。通過(guò)對(duì)NHK和其非糖基化版本的研究，課題組展示了該系統(tǒng)可以相對(duì)定量地檢測(cè)ER中未折疊蛋白的積累程度，并在不同濃度的條件下顯示出量效關(guān)系。此外，還探討了蛋白質(zhì)翻譯抑制劑環(huán)放線菌酮（CHX）對(duì)斑點(diǎn)形成的影響。CHX能抑制蛋白翻譯，降低進(jìn)入ER腔蛋白量，從而抑制ER腔內(nèi)未折疊蛋白的聚集。研究人員發(fā)現(xiàn)CHX可以顯著抑制由ER應(yīng)激引起的熒光斑點(diǎn)的形成，這表明該系統(tǒng)能夠反映ER蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將熒光報(bào)告系統(tǒng)用于解析ER應(yīng)激和UPR的關(guān)系。蛋白酶體抑制劑硼替佐米（Bortezomib）是一種抗癌藥。通常，蛋白酶體抑制劑通過(guò)阻礙ER相關(guān)蛋白降解（ERAD）來(lái)導(dǎo)致ER中未折疊蛋白積累，引發(fā)ER應(yīng)激。然而，這與某些情況下觀察到的UPR抑制現(xiàn)象相矛盾。為了解釋這一現(xiàn)象，研究者用bortezomib處理穩(wěn)定表達(dá)PERK(LD)-EGFP-HOTag3的HeLa細(xì)胞。結(jié)果顯示，盡管bortezomib誘導(dǎo)了eIF2α磷酸化和ATF4表達(dá)，但并未引起PERK磷酸化或XBP1 mRNA剪接，也沒(méi)有促進(jìn)熒光斑點(diǎn)的形成，表明它未在ER中導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊。此外，bortezomib顯著抑制了蛋白糖基化抑制劑tunicamycin處理細(xì)胞中的熒光斑點(diǎn)形成和UPR。相比之下，在MDA-MB-231細(xì)胞中，bortezomib促進(jìn)了PERK的磷酸化和XBP1 mRNA剪接，并增加了斑點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞的比例。有意思的是在相同劑量的bortezomib處理下，MDA-MB-231顯示出明顯高于HeLa的凋亡水平。這表明不同細(xì)胞類型對(duì)bortezomib的UPR響應(yīng)存在差異，而這也許與腫瘤細(xì)胞對(duì)這一抗癌藥的敏感性有關(guān)。這些結(jié)果揭示了Bortezomib在不同細(xì)胞類型中，通過(guò)不同機(jī)制調(diào)控UPR和未折疊蛋白積累的復(fù)雜性。此外，研究人員還觀察了不同濃度的ER鈣泵抑制劑thapsigargin (Tg)處理下，細(xì)胞中ER應(yīng)激強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。過(guò)去的研究表明，在持續(xù)的ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑刺激下，細(xì)胞中UPR信號(hào)-XBP1 mRNA剪接-的水平會(huì)出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，但人們并不清楚XBP1 mRNA剪接水平的下降是因?yàn)镋R應(yīng)激的緩解還是IRE1-XBP1信號(hào)通路受阻。他們的結(jié)果表明，在低濃度Tg（0.01 μM）處理下，熒光斑點(diǎn)隨時(shí)間消失，表明ER穩(wěn)態(tài)恢復(fù)；而在高濃度Tg（0.2 μM）處理下，熒光斑點(diǎn)持續(xù)存在，且細(xì)胞凋亡增加。這表明，在輕度ER應(yīng)激下，UPR的減弱可能意味著穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，但在嚴(yán)重ER應(yīng)激下，這可能表明ER傳感器失效，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
這項(xiàng)研究不僅深化了我們對(duì)ER應(yīng)激和UPR機(jī)制的理解，還展示了如何通過(guò)創(chuàng)新的生物技術(shù)手段在細(xì)胞水平上直接觀察這些關(guān)鍵的生物過(guò)程。研究人員計(jì)劃進(jìn)一步應(yīng)用這一系統(tǒng)來(lái)探究在多種生理及生理病理?xiàng)l件下ER中的蛋白質(zhì)狀態(tài)，尤其是在腫瘤、代謝疾病和病毒感染等背景下。綜上所述，這項(xiàng)研究揭示了ER 應(yīng)激與UPR之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制，為解碼這些過(guò)程如何在健康和疾病中發(fā)揮作用提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。這一發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了新的視野，特別是在涉及ER應(yīng)激相關(guān)的疾病，如神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和癌癥等領(lǐng)域。
模式圖（引自原文）。該研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)熒光報(bào)告系統(tǒng)來(lái)觀察活細(xì)胞ER腔內(nèi)未折疊蛋白的積累。在未折疊蛋白結(jié)合后，該系統(tǒng)快速且可逆地形成熒光斑點(diǎn)，實(shí)時(shí)可視化ER腔內(nèi)未折疊蛋白的積累，幫助人們更好地理解ER應(yīng)激如何與UPR相關(guān)。
中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的王立堃研究員為論文的通訊作者，博士生徐芬芬為第一作者。該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)和青年交叉團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目的資助。
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114358
（文章來(lái)源:www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/20240619070018980.htm） | 
