染色體分離、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞增殖的其他過程是癌癥、衰老等多個(gè)研究領(lǐng)域的核心。細(xì)胞周期是高度協(xié)調(diào)并嚴(yán)格受控的，在單細(xì)胞水平具有適應(yīng)性和異質(zhì)性(1)。因此，計(jì)算工具將有助于此類研究，比如細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)研究(2)。
Bio-Rad公司流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用科學(xué)家Sharon Sanderson解釋說：“細(xì)胞周期分析領(lǐng)域正通過技術(shù)和方案的不斷創(chuàng)新而向前發(fā)展。單細(xì)胞測序和高通量成像技術(shù)正幫助我們認(rèn)識細(xì)胞周期及其與生物過程和疾病的相關(guān)性，但長期的細(xì)胞增殖研究需要無毒性方法。”
細(xì)胞周期分析的熱度也許可以從其全球市場規(guī)模中略窺一斑。根據(jù)市場研究機(jī)構(gòu)Market Research Future的預(yù)測，到2030年，全球細(xì)胞周期分析的市場規(guī)模將達(dá)到163億美元，復(fù)合年均增長率達(dá)到9.80% (3)。
那么，細(xì)胞周期分析將如何推進(jìn)您的研究項(xiàng)目？在此，我們將介紹一些有代表性的解決方案，以及分析工具和方法開發(fā)方面的最新進(jìn)展。
流式細(xì)胞術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)仍然是細(xì)胞周期分析時(shí)的主要工具。Cytek Biosciences公司流式細(xì)胞術(shù)分析和應(yīng)用總監(jiān)Kamala Tyagarajan表示：“Cytek Northern Lights全光譜流式細(xì)胞儀功能強(qiáng)大，不僅能夠開展高參數(shù)的多重分析，還能輕松運(yùn)行傳統(tǒng)的低參數(shù)分析。”
“全光譜流式細(xì)胞儀采集每個(gè)熒光基團(tuán)的整個(gè)光譜，而不像傳統(tǒng)儀器那樣檢測分散的波長。這為熒光染料和試劑的組合使用帶來了靈活性，即使發(fā)射峰重疊也沒問題。Cytek Northern Lights系統(tǒng)在檢測感興趣的群體方面具有高的靈敏度和分辨率，這對細(xì)胞周期分析非常重要，”Tyagarajan補(bǔ)充說。
傳統(tǒng)的細(xì)胞周期染料與流式細(xì)胞術(shù)兼容，但存在很大的限制，例如與活細(xì)胞分析不兼容。細(xì)胞增殖的指示物或標(biāo)志物已成為替代的分子成像靶點(diǎn)，與細(xì)胞周期狀態(tài)相對應(yīng)。據(jù)Sanderson介紹，alamarBlue能夠快速經(jīng)濟(jì)地定量各個(gè)細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖和毒性，用于時(shí)間進(jìn)程研究，而且比四唑鹽（MTT）染料更安全。
“alamarBlue不會(huì)干擾細(xì)胞呼吸和功能，其專有的緩沖液使其高度穩(wěn)定。在指示劑存在的情況下，細(xì)胞仍然能保持完整的功能和活力，可用于藥物敏感性和代謝研究等一系列應(yīng)用，而且可輕松放大到高通量分析，” Sanderson談道。
Sanderson指出，alamarBlue的活性成分是刃天青（resazurin），這是一種具有細(xì)胞滲透性的無毒化合物，呈藍(lán)色且?guī)缀鯖]有熒光。在進(jìn)入活細(xì)胞后，刃天青被還原，呈現(xiàn)紅色并發(fā)出強(qiáng)烈熒光。因此，通過這種試劑可檢測呼吸過程中的氧化水平，定量測定細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性，直接反映了細(xì)胞健康狀況。
Absolute Biotech公司的首席科學(xué)官Frans Ramaekers強(qiáng)調(diào)，流式分析不再局限于細(xì)胞表面分子。他提到了該公司的FIX&PERM細(xì)胞固定和透化緩沖液。
“通過使用FIX&PERM，細(xì)胞內(nèi)抗原的流式細(xì)胞分析也變得像表面抗原研究一樣簡單。FIX&PERM方案適用于研究外周血細(xì)胞樣本、骨髓抽吸物、單核細(xì)胞懸液以及用實(shí)體組織和培養(yǎng)細(xì)胞制備的細(xì)胞懸液，”他談道。
“一方面通過FIX&PERM來分析Ki-67和Bcl-2，另一方面利用廣泛的骨髓細(xì)胞分化標(biāo)志物，研究人員能夠分析正常骨髓和骨髓瘤患者抽吸物中不同亞型的成熟造血細(xì)胞的增殖和抗凋亡活性，” Ramaekers繼續(xù)說。“這有助于人們更好地了解骨髓惡性腫瘤的潛在致病機(jī)制。”
成像流式細(xì)胞術(shù)
許多研究人員已將流式細(xì)胞術(shù)與微流控技術(shù)等其他模式相結(jié)合，以提高其在臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究中的實(shí)用性。例如，成像流式細(xì)胞術(shù)克服了流式細(xì)胞術(shù)缺乏單細(xì)胞分辨率和光學(xué)顯微鏡通量較低的局限性(4)。
在一篇預(yù)印本文章中，Howell等人利用Cytek公司的ImageStream®X Mk II成像流式細(xì)胞儀來評估墨西哥利什曼原蟲（Leishmania mexicana）的DNA復(fù)制、細(xì)胞形狀和有絲分裂狀態(tài)(5)。
對于成像流式細(xì)胞術(shù)而言，如何優(yōu)化數(shù)據(jù)分析的自動(dòng)化是一項(xiàng)長期的挑戰(zhàn)。因此，Pozzi等人回顧了成像流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)有望通過人工智能來解決(6)。
第一，圖像處理應(yīng)當(dāng)在微秒尺度上準(zhǔn)確進(jìn)行，以便根據(jù)衰老狀態(tài)等進(jìn)行細(xì)胞分類。第二，輔助數(shù)據(jù)自動(dòng)化將減少開發(fā)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集（如細(xì)胞周期的形態(tài)指標(biāo)）所需的時(shí)間。第三，有必要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案標(biāo)準(zhǔn)化，以促進(jìn)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)解讀。
質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)
質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（mass cytometry）是質(zhì)譜分析的一種變形，在細(xì)胞周期研究中越來越受歡迎。它不是像流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡分析那樣采用熒光（光學(xué)）檢測，而是采用同位素作為金屬標(biāo)簽，在細(xì)胞霧化后進(jìn)行定量。組織切片也可以霧化，從而提供生物標(biāo)志物分布的擬圖像。
利用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)，研究人員可以獲得細(xì)胞周期狀態(tài)及其他代謝特征的相關(guān)指標(biāo)(7)。目前，這種方法可以同時(shí)分析多達(dá)50種生物標(biāo)志物，而且不會(huì)出現(xiàn)光譜重疊或背景干擾(8)。
Abdul-Aziz等人評估了質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)在評估細(xì)胞衰老方面的作用(9)。他們在單細(xì)胞水平上定量了p16表達(dá)（癌癥研究的常見靶點(diǎn)）以及與細(xì)胞周期相對應(yīng)的其他標(biāo)志物。在WI-38細(xì)胞中，經(jīng)過10天的氧化應(yīng)激，S期的細(xì)胞數(shù)量減少，而G0期的細(xì)胞數(shù)量增加。由于單細(xì)胞質(zhì)譜流式分析可以在數(shù)天內(nèi)完成，研究人員認(rèn)為，這種方法可能有助于血液腫瘤治療、干細(xì)胞移植及其他醫(yī)學(xué)治療的監(jiān)測。
在癌癥和衰老等研究領(lǐng)域，細(xì)胞周期分析將繼續(xù)成為熱點(diǎn)。相關(guān)的數(shù)據(jù)分析可能帶來挑戰(zhàn)，尤其是高通量應(yīng)用中或樣本存在大量異質(zhì)性時(shí)。不過，目前的許多工具和方案（包括自動(dòng)化技術(shù)）可以簡化這項(xiàng)任務(wù)。
參考文獻(xiàn)
1. Stallaert W, et al. (2022). The structure of the human cell cycle. Cell Syst. 13(3):230–240.
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3. Market Research Future (2024). Cell cycle analysis market research report information by product (consumables, instruments, & others), application (cell identification and others), end-user (academics & research institutions, hospitals & diagnostic laboratories, & others) – Global forecast till 2030. Rep. MRFR/LS/0202-HCR, New York.
4. Rees P, et al. (2022). Imaging flow cytometry. Nat. Rev. Methods Primers 2:86.
5. Howell J, et al. (2023). The use of imaging flow cytometry for rapid, high-throughput and automated analysis of the Leishmania mexicana promastigote cell cycle provides new insights into cell cycle events of short duration. bioRxiv preprint 2023.07.24.550259 (accessed Jan 8, 2024).
6. Pozzi P, et al. (2023). Artificial intelligence in imaging flow cytometry. Front. Bioinform. 3:1229052.
7. Zhao Y, et al. (2022). Physical cytometry: Detecting mass-related properties of single cells. ACS Sens. 7(1):21–36.
8. Arnett LP, et al. (2023). Reagents for mass cytometry. Chem. Rev. 123(3):1166–1205.
9. Abdul-Aziz A, et al. (2023). Mass cytometry as a tool for investigating senescence in multiple model systems. Cells 12(16):2045.
（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-5）
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