標(biāo)記和可視化蛋白質(zhì)是研究細(xì)胞生物學(xué)的基本工具，可以用于監(jiān)測蛋白質(zhì)動態(tài)變化和解析細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜相互作用，從而理解特定感興趣蛋白質(zhì)（protein of interest, POI）的細(xì)胞功能。熒光成像技術(shù)在活細(xì)胞中研究蛋白質(zhì)定位、功能及互作方面發(fā)揮著巨大作用。目前，常用的標(biāo)記方法都有一定的局限性，例如抗體染色不能應(yīng)用與活細(xì)胞，而小分子化學(xué)探針又缺乏通用型。目前最常用的是基因融合（使用熒光蛋白、自標(biāo)記酶或肽標(biāo)簽），然而該方法通常需要過表達(dá)編碼POI的開放閱讀框架（ORF），可能對蛋白質(zhì)的正常表達(dá)、折疊、定位和功能造成干擾。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的方法，通過基因編輯原位敲入編碼熒光蛋白或特定標(biāo)簽的基因提供了高度精確的內(nèi)源蛋白質(zhì)標(biāo)記方法。然而基因編輯方法可能對細(xì)胞造成致命或不可逆的影響，導(dǎo)致可能引起錯誤結(jié)論的人為現(xiàn)象。此外，在POI的基因序列編碼的N-或C-末端附近進(jìn)行標(biāo)簽插入的可編輯PAM位點(diǎn)通常對許多蛋白質(zhì)不可用，限制了基于基因編輯的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法的實(shí)用性。因此，亟需開發(fā)一種真正靈活和普遍適用的方法來標(biāo)記內(nèi)源蛋白，以填補(bǔ)現(xiàn)有蛋白標(biāo)記技術(shù)的空白。
2024年2月1日，北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉濤團(tuán)隊(duì)在Nature Chemical Biology雜志發(fā)表了題為Tracking endogenous proteins based on RNA editing-mediated genetic code expansion的研究論文。研究者基于RNA編輯介導(dǎo)的非經(jīng)典氨基酸（ncAAs）蛋白質(zhì)標(biāo)記（RENAPT）方法，RNA編輯系統(tǒng)在不改變基因序列的同時，實(shí)現(xiàn)在目標(biāo)蛋白mRNA水平引入終止密碼子，且不受PAM序列的限制。然后通過非經(jīng)典氨基酸系統(tǒng)，將熒光ncAA或具有生物正交反應(yīng)手柄的ncAA進(jìn)行后續(xù)染料標(biāo)記在活細(xì)胞中，僅使用最小的氨基酸側(cè)鏈標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)特異性地標(biāo)記多種內(nèi)源蛋白質(zhì)（圖1）。該研究擴(kuò)展了內(nèi)源蛋白標(biāo)記方法，提供了一個廣泛適用的平臺，可以在活細(xì)胞中標(biāo)記內(nèi)源蛋白質(zhì)，以研究其定位和功能。
圖1 RENAPT系統(tǒng)在活細(xì)胞中標(biāo)記內(nèi)源蛋白
研究內(nèi)容
1 RENAPT系統(tǒng)用于標(biāo)記內(nèi)源蛋白
為了在活細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)內(nèi)源蛋白的實(shí)時示蹤，作者首先驗(yàn)證了RNA編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)C到U的編輯效率，然后通過肽段質(zhì)譜，確認(rèn)了ncAAs可以位點(diǎn)特異性的整合到目標(biāo)蛋白中。然后選擇內(nèi)源蛋白GRP94的不同位點(diǎn)進(jìn)行了標(biāo)記驗(yàn)證（圖2）。
圖2 RENAPT系統(tǒng)蛋白標(biāo)記驗(yàn)證
直接觀察蛋白質(zhì)定位可以為研究蛋白質(zhì)功能和相互作用提供重要的信息，因此，作者使用了一組已知亞細(xì)胞定位的內(nèi)源蛋白，利用RENAPT系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時標(biāo)記。可以觀察到目標(biāo)內(nèi)源性蛋白質(zhì)（GRP94Q452UAG ATP5AQ439UAG和IGF2-RQ506UAG）與各自的亞細(xì)胞定位熒光探針呈強(qiáng)烈的共定位信號（圖3）。
圖3 RENAPT用于不同內(nèi)源蛋白的亞細(xì)胞定位
2 RENAPT系統(tǒng)進(jìn)行蛋白雙標(biāo)記
雙標(biāo)記系統(tǒng)在蛋白標(biāo)記中的應(yīng)用可以幫助研究人員更全面地理解蛋白質(zhì)的功能、相互作用和定位。組蛋白H3.3a和H3.3b分別由H3f3a和H3f3b基因編碼，它們在氨基酸序列上完全相同，但堿基序列不同。利用RENAPT系統(tǒng)，可以區(qū)分這2個蛋白，并對其分別進(jìn)行標(biāo)記，如圖4a所示。通過使用雙標(biāo)記系統(tǒng)，研究它們在細(xì)胞內(nèi)的定位。隨后，作者們對溶酶體蛋白IGF2-RQ506UAG和線粒體蛋白ATP5AR330UGA進(jìn)行了雙標(biāo)記（圖4b）。
圖4 RENAPT雙標(biāo)記系統(tǒng)。a. 雙標(biāo)記histone H3.3a-mCherry 和 histone H3.3b-eGFP蛋白. b. 雙標(biāo)記內(nèi)源ATP5A 和 IGF2-R蛋白.
3 RENAPT系統(tǒng)用于超分辨成像
作者通過HIS-SIM超分辨成像系統(tǒng)對內(nèi)源蛋白ATP5AQ439UAG、IGF2-RQ506UAG和GRP94Q452UAG進(jìn)行超分辨成像（圖5），得到了與相應(yīng)的亞細(xì)胞熒光探針光譜重疊高度的共定位結(jié)果，PCC系數(shù)值在0.77-0.97之間。證明RENAPT系統(tǒng)可以用于超分辨成像的研究，可以幫助我們更清晰地觀察和研究細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、更深入地理解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，并為生命科學(xué)研究提供更多的可能性。
圖5 利用RENAPT進(jìn)行超分辨成像
4. RENAPT系統(tǒng)用于原代海馬細(xì)胞內(nèi)源蛋白標(biāo)記
利用RENAPT系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源蛋白的高分辨率、高靈敏度和長時間的動態(tài)成像。Nav1.6負(fù)責(zé)神經(jīng)元動作電位的起始和傳導(dǎo)，并通過與ankG膜結(jié)構(gòu)域相互作用而聚集在AIS遠(yuǎn)端。與ankG和Nav1.6抗體染色的共定位分析表明，RENAPT可以有效地標(biāo)記Nav1.6（圖6）。類似地， Cav2.1和NFL分別與對應(yīng)的抗體和神經(jīng)標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白2（MAP2）進(jìn)行標(biāo)記，研究共定位效果。這些結(jié)果證實(shí)，RENAPT可以成功地標(biāo)記原代海馬細(xì)胞中的內(nèi)源性蛋白，這將有助于今后對它們表達(dá)、定位、相互作用和功能進(jìn)行研究。
圖6 RENAPT用于小鼠海馬細(xì)胞內(nèi)源蛋白標(biāo)記
該研究開發(fā)的RENAPT系統(tǒng)跨越了傳統(tǒng)的內(nèi)源蛋白標(biāo)記技術(shù)，直接在RNA水平實(shí)現(xiàn)對內(nèi)源目標(biāo)蛋白是實(shí)時示蹤標(biāo)記，擴(kuò)展了內(nèi)源蛋白質(zhì)標(biāo)記的方法，為更清晰地觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分布提供了新的平臺。文章首次結(jié)合RNA編輯與非經(jīng)典氨基酸整合技術(shù)應(yīng)用于內(nèi)源蛋白標(biāo)記系統(tǒng)，并且可以應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的標(biāo)記，期待未來科學(xué)家能夠進(jìn)一步拓展該系統(tǒng)在其他方面的應(yīng)用。
北京大學(xué)博士后郝敏，博士生凌鑫宇和講師孫懿為本文的共同第一作者。團(tuán)隊(duì)成員王雪，常麗穎，曾志英，牛夢曉，天然藥物及仿生藥物全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室儀器平臺指導(dǎo)老師李文哲、師曉萌、姜竺君和張曉輝也為本研究做出了重要貢獻(xiàn)。北京大學(xué)陳良怡教授為本研究做出了重要技術(shù)支持。通訊作者為北京大學(xué)藥學(xué)院劉濤研究員。該研究獲得中國國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、國家科技重大專項(xiàng)計(jì)劃、中國博士后科學(xué)基金和北京市自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-023-01533-w
（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-2） | 
