| 9月11日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李龍研究員課題組在Nature Structural & Molecular Biology雜志發(fā)表題為“Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex”的論文。該研究報(bào)道了線粒體中介導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和生化結(jié)果，揭示了蛋白質(zhì)通過(guò)TOM復(fù)合物跨越線粒體外膜的新途徑，并重新定義了線粒體內(nèi)膜TIM23轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物的核心組成。
線粒體作為真核細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一，在能量供應(yīng)、胞內(nèi)代謝、體內(nèi)平衡和細(xì)胞凋亡等過(guò)程中都扮演重要的角色。線粒體具有獨(dú)特的內(nèi)外雙層脂膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部分布著超過(guò)1000種蛋白質(zhì)。99%的線粒體蛋白質(zhì)都是由細(xì)胞核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)的核糖體中合成，并跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中發(fā)揮功能。因此，線粒體蛋白質(zhì)的運(yùn)輸對(duì)于維持和調(diào)控線粒體的活性至關(guān)重要，相關(guān)基因的突變與人類許多代謝疾病和癌癥的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)。李龍課題組一直致力于探究線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體的分子機(jī)制，已經(jīng)發(fā)表的工作包括解析線粒體膜蛋白通過(guò)TIM22轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物進(jìn)入內(nèi)膜的途徑（Zhang Y. et al Cell Research 2021）。此次研究的TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合物在線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用更為重要。這個(gè)超級(jí)復(fù)合物由數(shù)十種蛋白亞基組裝而成，跨越線粒體內(nèi)外雙層膜，控制超過(guò)500種線粒體可溶蛋白和膜蛋白的運(yùn)輸。在過(guò)去的40年里，研究人員對(duì)TOM和TIM23轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的各個(gè)亞基進(jìn)行了廣泛而深入的研究。然而，由于該超級(jí)復(fù)合物的高度動(dòng)態(tài)性，人們對(duì)于這些亞基如何組裝形成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通路這一核心問(wèn)題的了解仍然非常有限，尤其是內(nèi)膜中的TIM23復(fù)合物，其核心轉(zhuǎn)運(yùn)單元的組成一直很不明確。
在此項(xiàng)研究中，作者首先從組裝穩(wěn)定的TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合物入手，探索多種組裝方案，最終選擇將綠色熒光蛋白與線粒體蛋白質(zhì)融合作為轉(zhuǎn)運(yùn)底物，在酵母細(xì)胞內(nèi)捕獲了TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)底物的中間狀態(tài)。經(jīng)過(guò)體外提純，這種中間態(tài)仍然可以穩(wěn)定存在，用于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)研究。通過(guò)冷凍電子顯微鏡單顆粒分析該中間態(tài)，作者發(fā)現(xiàn)位于外膜的TOM復(fù)合物和位于內(nèi)膜的TIM23復(fù)合物存在直接相互作用，將線粒體內(nèi)外膜連接起來(lái)，從而高效地將蛋白質(zhì)底物從線粒體外膜向內(nèi)膜傳遞（圖1a）。其中，TOM復(fù)合物的分辨率解析到了4.1?，該結(jié)構(gòu)揭示了一條位于Tom40通道亞基內(nèi)壁、在各個(gè)物種中都很保守的“極性氨基酸路徑”，該路徑介導(dǎo)蛋白質(zhì)底物以非折疊的形式通過(guò)Tom40的中間孔道（圖1b）。這條路徑與之前基于生化實(shí)驗(yàn)提出的Tom40中的兩條跨膜路徑均不相同，顯示出TOM復(fù)合物在高效識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)各種線粒體蛋白質(zhì)過(guò)程中的多能性。
圖1. TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。(a)TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合物的組裝示意圖和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。(b)包含蛋白質(zhì)底物的TOM復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)模型。(c) Tim17-Tim23-Mgr2異源三聚體的AlphaFold2結(jié)構(gòu)模型
此外，作者在蛋白質(zhì)底物的不同位點(diǎn)系統(tǒng)性地引入非天然氨基酸，利用光交聯(lián)技術(shù)探測(cè)了TOM-TIM23的轉(zhuǎn)運(yùn)通路中蛋白質(zhì)底物的周圍環(huán)境，從而鑒定出直接幫助底物跨越兩層脂膜的核心亞基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)底物的C端片段可以與外膜的Tom40亞基交聯(lián)，這一結(jié)果與結(jié)構(gòu)觀測(cè)相符。然而，令人意外的是，蛋白質(zhì)底物的N端片段在內(nèi)膜中與Tim17和Mgr2兩個(gè)亞基交聯(lián)，而不與普遍認(rèn)定的構(gòu)成內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道的Tim23亞基交聯(lián)。這一結(jié)果表明，在過(guò)去的研究中，對(duì)TIM23復(fù)合物核心轉(zhuǎn)運(yùn)通路的認(rèn)知可能存在重大偏差。為了進(jìn)一步確定TIM23中的核心轉(zhuǎn)運(yùn)亞基及通路，作者綜合利用AlphaFold2建模、生化交聯(lián)、酵母遺傳學(xué)和線粒體蛋白質(zhì)體外轉(zhuǎn)運(yùn)等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TIM23復(fù)合物的核心成分是一個(gè)由Tim23、Tim17和Mgr2亞基組成的異源三聚體，其中Tim17和Mgr2面對(duì)面形成一個(gè)通道狀結(jié)構(gòu)，而Tim23以背靠背的形式與Tim17結(jié)合，不參與通道的形成（圖1c）。在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，蛋白質(zhì)底物穿過(guò)Tim17和Mgr2形成的通道狀結(jié)構(gòu)，不直接與Tim23亞基接觸。突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酵母中敲除Mgr2并不影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，說(shuō)明在Tim17和Mgr2組成的通道狀結(jié)構(gòu)中，只有Tim17是必需的。Tim17之所以可以幫助蛋白質(zhì)穿過(guò)內(nèi)膜是由于其獨(dú)特的表面氨基酸分布：一方面，Tim17在內(nèi)膜入口處有一個(gè)高度保守的負(fù)電區(qū)域，可以破壞局部磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，降低蛋白質(zhì)穿過(guò)脂膜的能量勢(shì)壘；另一方面，在通路的中心，Tim17有一個(gè)保守的疏水區(qū)域，有助于線粒體內(nèi)膜保持密閉狀態(tài)，維持線粒體各項(xiàng)生理活動(dòng)所需的膜電勢(shì)。綜合各項(xiàng)結(jié)構(gòu)和生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)定TIM23復(fù)合物以Tim17亞基為核心，采取混合模式幫助蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，即Tim17可以與其他亞基動(dòng)態(tài)結(jié)合形成幫助蛋白質(zhì)跨膜的通道，或者Tim17以插入酶的工作模式單獨(dú)完成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，不需要通道的形成。這一結(jié)果更正了過(guò)去40年領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)為Tim23亞基構(gòu)成核心通道的錯(cuò)誤認(rèn)知。
綜上所述，這項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了一套新穎的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)研究策略，揭示了線粒體蛋白質(zhì)通過(guò)TOM-TIM23超級(jí)復(fù)合物穿越雙層脂膜的關(guān)鍵路徑（圖2），顛覆了長(zhǎng)期以來(lái)領(lǐng)域里對(duì)內(nèi)膜TIM23轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的核心組分的認(rèn)知，發(fā)現(xiàn)了全新的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)酶工作模式，為全面深入理解線粒體的生物合成奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
圖2. 線粒體TOM-TIM23轉(zhuǎn)運(yùn)通路
李龍為該論文通訊作者，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心2018級(jí)博士生周雪垠、生命科學(xué)學(xué)院2019級(jí)博士生楊玉琪、北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)王國(guó)鵬博士和生命科學(xué)學(xué)院2020級(jí)博士生王珊珊為共同第一作者。李龍實(shí)驗(yàn)室前技術(shù)員孫東杰，生命科學(xué)學(xué)院2022級(jí)博士生歐曉敏、2021級(jí)博士生連宇珂為該研究工作作出重要貢獻(xiàn)。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧教授和李寧寧副研究員、中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所章新政研究員在冷凍電鏡數(shù)據(jù)計(jì)算方面提供了極大幫助，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李晴教授和昌增益教授分別對(duì)酵母遺傳學(xué)和光交聯(lián)實(shí)驗(yàn)提供了重要指導(dǎo)。該研究工作得到北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、高性能計(jì)算中心、生命科學(xué)學(xué)院儀器中心以及國(guó)家鳳凰蛋白質(zhì)平臺(tái)的大力支持，獲得膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的資助。
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