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| 高通量單核RNA測(cè)序新突破，助力生物醫(yī)學(xué)研究 |
| [ 發(fā)布日期：2023-8-4 8:56:00 閱讀次數(shù)：589 ] |
近日，浙江大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了一種全新的高通量單核總RNA測(cè)序技術(shù)snRandom-seq，并成功用于福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-fixed paraffin-embedding，F(xiàn)FPE）組織的檢測(cè)。這種方法具有高準(zhǔn)確性和靈敏度，可廣泛應(yīng)用于臨床FFPE樣本的生物醫(yī)學(xué)研究。
福爾馬林固定石蠟包埋是醫(yī)院保存病理組織最常用的方法，并且也是分子生物學(xué)研究中珍貴的材料來(lái)源。在腫瘤研究中，石蠟包埋組織能夠提供重要的基因信息，與臨床病史和隨訪資料的建立密切相關(guān)。在制備過(guò)程中，福爾馬林會(huì)與組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的交聯(lián)反應(yīng)以保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，但這一過(guò)程不可避免地會(huì)損害核酸等大分子，從而給核酸提取和后續(xù)測(cè)序工作帶來(lái)挑戰(zhàn)。
FFPE樣本的轉(zhuǎn)錄分析近年來(lái)飛速發(fā)展，特別是單細(xì)胞的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄組學(xué)有助于更好地了解其細(xì)胞異質(zhì)性和群體動(dòng)態(tài)，然而從中分離單個(gè)完整細(xì)胞并獲得RNA仍然面臨挑戰(zhàn)。此外，目前高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)所采用的方法往往受限于樣本的新鮮程度，大多無(wú)法高效地應(yīng)用于FFPE。因此，亟需一種能夠?qū)FPE組織進(jìn)行高通量、高靈敏度和高覆蓋度的單核RNA測(cè)序方法。
為了解決這一挑戰(zhàn)，浙江大學(xué)的王永成團(tuán)隊(duì)于2023年5月在《自然-通訊》發(fā)表了一項(xiàng)研究1，開(kāi)發(fā)了一種適用于FFPE樣本的新型、高靈敏度全長(zhǎng)單核RNA測(cè)序方法snRandom-seq，并與躍真生物（M20 Genomics）合作嘗試將此方法商業(yè)化。該方法突破性和創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：對(duì)于樣本制備，研究人員改進(jìn)了脫蠟、補(bǔ)液和細(xì)胞核提取方法，實(shí)現(xiàn)在溫和條件下從 FFPE 組織中分離得到單個(gè)完整細(xì)胞核，在此基礎(chǔ)上通過(guò)設(shè)計(jì)單鏈 DNA 阻斷步驟，以避免基因組DNA對(duì)RNA樣本的污染；在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，研究人員采用了隨機(jī)引物，能夠無(wú)偏差地獲得全長(zhǎng)總RNA中的所有信息，并將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA，相較于傳統(tǒng)方法具有更高的覆蓋度；在獲得的單鏈DNA上添加poly(A)尾，以用于后續(xù)添加每個(gè)細(xì)胞特有的識(shí)別信息及雙鏈DNA的合成；最后，研究人員使用王永成團(tuán)隊(duì)之前所建立的微流體條形碼平臺(tái)，將含有特異識(shí)別信息和引物的微珠與單個(gè)細(xì)胞包裹在液滴中，對(duì)單鏈DNA進(jìn)行高通量標(biāo)記，標(biāo)記后的DNA從液滴中釋放并進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的試劑盒和微珠等由躍真生物提供。
為了驗(yàn)證snRandom-seq的表現(xiàn)，研究人員使用人鼠混合樣本對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明該方法具有極高的準(zhǔn)確度和靈敏度。團(tuán)隊(duì)還使用該方法對(duì)小鼠組織樣本進(jìn)行研究，其在單核RNA測(cè)序及細(xì)胞類型注釋過(guò)程中都表現(xiàn)良好，平均每個(gè)單細(xì)胞核可注釋到3000多個(gè)基因，并能夠識(shí)別 25 種典型細(xì)胞類型，如肝細(xì)胞、生殖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞 、心肌細(xì)胞等。與目前可應(yīng)用于FFPE樣本的同類測(cè)序方法相比，snRandom-seq在細(xì)胞類型鑒定、差異表達(dá)分析和細(xì)胞周期相分析方面均具有明顯優(yōu)勢(shì)。
此外，研究者將該方法應(yīng)用于臨床人肝癌FFPE標(biāo)本的分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的具有高增殖活性的細(xì)胞核亞群，可能是癌癥研究的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)snRandom-seq技術(shù)從臨床FFPE標(biāo)本中獲得高質(zhì)量和高靈敏度的數(shù)據(jù)，研究人員可以揭示細(xì)胞類型特異性靶基因或識(shí)別罕見(jiàn)亞群，從而對(duì)疾病進(jìn)行精確診斷和治療。
snRandom-seq技術(shù)為實(shí)驗(yàn)室和臨床 FFPE 樣本提供了一個(gè)強(qiáng)大的單核RNA測(cè)序平臺(tái)，有望彌補(bǔ)已有方法在FFPE樣本測(cè)序方面的缺陷，未來(lái)在生物學(xué)研究和臨床實(shí)踐中具有極大的應(yīng)用潛力。
參考文獻(xiàn)：
1. Xu, Z., Zhang, T., Chen,H. et al. Nat Commun 14, 2734 (2023).
Nature Communications
DOI:10.1038/s41467-023-38409-5
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