| CRISPR-Cas基因編輯在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐上有重大的應(yīng)用潛力，已經(jīng)成為了當(dāng)前生物醫(yī)藥研究中的熱點(diǎn)。目前廣泛使用的Cas9和Cas12a基因編輯系統(tǒng)存在分子量大、遞送困難、編輯位點(diǎn)有限、易于脫靶等缺陷。同時(shí)，這些基因編輯系統(tǒng)的底層專利均歸屬于歐美國(guó)家。自然界中存在著種類豐富的CRISPR-Cas系統(tǒng)，但其中被挖掘和表征的系統(tǒng)只是其中的冰山一角。研究和開(kāi)發(fā)具有獨(dú)特性質(zhì)的新穎CRISPR-Cas編輯系統(tǒng)，對(duì)于推測(cè)CRISPR-Cas的演化機(jī)制，豐富CRISPR-Cas基因編輯工具庫(kù)，推動(dòng)CRISPR-Cas的應(yīng)用和獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因編輯系統(tǒng)都具有重要意義。
上?？萍即髮W(xué)季泉江課題組在 Molecular Cell 期刊發(fā)表了題為：Cas12n, early evolutionary intermediate nucleases of type V CRISPR, comprise a distinct family of miniature genome editors 的研究論文。
該研究成功開(kāi)發(fā)了一類能在細(xì)菌和人類細(xì)胞中進(jìn)行高效基因組編輯的新型微型CRISPR-Cas12n系統(tǒng)。
CRISPR-Cas12n是一類V-U4型CRISPR-Cas系統(tǒng)，與V型CRISPR系統(tǒng)的祖先——轉(zhuǎn)座相關(guān)核酸酶TnpB具有最近的親緣關(guān)系，可能是TnpB演化為其它V型Cas核酸酶的最早進(jìn)化中間體。目前尚沒(méi)有對(duì)該類CRISPR-Cas系統(tǒng)的性質(zhì)和功能的研究報(bào)道。
研究人員對(duì)CRISPR-Cas12n進(jìn)行了系統(tǒng)表征并發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas12n是一類微型基因編輯系統(tǒng)（僅含400-700個(gè)氨基酸），識(shí)別罕見(jiàn)的AAN PAM序列， tracrRNA位于Cas12n mRNA內(nèi)部，對(duì)被靶DNA序列產(chǎn)生兩次切割，效應(yīng)復(fù)合體中Cas12n核酸酶可能為單體分子。這些特征均與TnpB較為相似，這進(jìn)一步證明了Cas12n與TnpB兩者之間的親緣性。與同為V型CRISPR系統(tǒng)的Cas12a和Cas12f相比，Cas12n系統(tǒng)在PAM識(shí)別序列、tracrRNA所在位置以及效應(yīng)復(fù)合物結(jié)構(gòu)特征方面均存在顯著差異。
在篩選了多種不同來(lái)源的CRISPR-Cas12n系統(tǒng)后，研究人員發(fā)現(xiàn)其中一種來(lái)源于海洋放線菌Actinomadura craniellae的Cas12n核酸酶（AcCas12n）具有較高的基因編輯活性。研究人員對(duì)AcCas12n系統(tǒng)進(jìn)行了相關(guān)表征，發(fā)現(xiàn)AcCas12n能夠高效地切割DNA雙鏈，產(chǎn)生黏性末端，并進(jìn)一步確定了切口特征。此外，研究人員系統(tǒng)性地探索了AcCas12n對(duì)反應(yīng)溫度、鹽離子濃度、二價(jià)金屬離子種類以及靶向序列長(zhǎng)度的選擇性，獲得了最適宜的反應(yīng)條件。該系統(tǒng)能夠在活細(xì)胞中進(jìn)行高效基因組編輯，在細(xì)菌中的編輯效率接近100%，而在人體細(xì)胞中的編輯效率，最高接近80%。
研究人員還對(duì)AcCas12n系統(tǒng)進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)對(duì)引導(dǎo)RNA (sgRNA) 的優(yōu)化改造，得到了優(yōu)化版本Cas12Pro，進(jìn)一步提升了該系統(tǒng)的編輯效率。此外，研究人員對(duì)Cas12Pro進(jìn)行了全面的表征，包括在人體細(xì)胞中多個(gè)不同位點(diǎn)的編輯效率檢測(cè)、使用腺相關(guān)病毒（AAV）載體在人體細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯、使用Guid-seq檢測(cè)細(xì)胞全基因組水平的脫靶效應(yīng)等。同時(shí)研究人員將Cas12Pro系統(tǒng)與目前最常用的Cas9和Cas12a系統(tǒng)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas12Pro系統(tǒng)在大多數(shù)位點(diǎn)的編輯效率接近Cas9和Cas12a系統(tǒng)，表明該系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。
CRISPR-Cas12n家族核酸酶是我國(guó)自主研發(fā)的新穎微型基因組編輯系統(tǒng)，擁有該家族系統(tǒng)的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)及底層專利。上海科技大學(xué)季泉江課題組前副研究員陳未中和博士研究生馬佳誠(chéng)為該論文的共同第一作者。上?？萍即髮W(xué)季泉江教授為通訊作者。上海科技大學(xué)為第一完成單位。
（文章來(lái)源：news.bioon.com/article/cbe7e8098222.html） | 
