英國劍橋醫(yī)學研究委員會(MRC)分子生物學實驗室的Julian Sale和Jason Chin的實驗室創(chuàng)造了兩種對大規(guī)?？焖倩蚪M構建至關重要的新工具。
這些工具，BASIS(細菌人工染色體逐步插入合成)和CGS(連續(xù)基因組合成)，解決了創(chuàng)建基因組的兩個最重要的問題:1)從更小的片段中快速組裝出大量的DNA; 2)以可擴展的方式用合成DNA取代生物體的基因組DNA。
BASIS和CGS使同時構建多個完全合成的基因組成為可能。作者利用這些基因組將人類基因組中“無疤痕”的大部分片段組合在一起。這一技術進步可以促進基因組水平上的高通量實驗和基因組文庫的創(chuàng)建。
詳細介紹這些方法的研究發(fā)表在《Nature》雜志上。
基因組的發(fā)展為定義基因組序列和它們編碼的功能之間的關系以及創(chuàng)造具有新穎和有用功能的生物體提供了前所未有的機會。大腸桿菌是一個很有吸引力的宿主，它可以將大量DNA片段組裝成片段，作為構建千兆酶級合成基因組的起點。但是，目前在大腸桿菌中組裝DNA的方法只能完成一次，使用非常小的DNA片段，使用留下疤痕的位點特異性重組酶，或者需要在體外將DNA片段線性化并電穿孔。
本文提出了一種利用BASIS快速拼接大堿基DNA的方法，以及利用CGS連續(xù)替換宿主DNA和外源DNA的方法。
Sale和Chin實驗室使用BASIS以高保真度從細菌人工染色體(BACs)中組裝了1.1 Mb的人類21號染色體切片。這種人類DNA包括許多外顯子、內(nèi)含子、重復序列、G-四聯(lián)體和長、短穿插核元素(LINEs和SINEs)。
然后，他們證明了含有大DNA的BASIS BACs為大腸桿菌的快速修飾和人類細胞中的表達提供了一個方便的平臺。為此，他們糾正了合成的囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR) BAC，將其轉(zhuǎn)染到人類細胞中，并證明了來自BAC的CFTR基因驅(qū)動了糾正的CFTR轉(zhuǎn)錄物的表達。
為了使CGS發(fā)揮作用，Sale和Chin實驗室發(fā)現(xiàn)了一種不太容易在外源DNA和宿主基因組之間交叉的大腸桿菌菌株，他們用這種菌株連續(xù)插入100 kb的合成DNA片段。作者利用該菌株在短短10天內(nèi)將來自5個片段的0.5 Mb DNA片段整合到大腸桿菌基因組中。他們相信，將CGS與快速寡核苷酸合成和片段體組裝相結合，以及將具有不同合成基因組片段的菌株的單個基因組組裝在一起的快速方法，將使他們能夠在不到兩個月的時間內(nèi)從功能設計中創(chuàng)建整個大腸桿菌基因組。
使用BASIS和CGS創(chuàng)建的DNA可用于將大量表觀DNA移動到人類，動物或植物細胞中，并在這些細胞中進行迭代重組，以將合成序列插入人工染色體或用合成序列替換染色體中的自然序列。
總之，快速組裝超大規(guī)模DNA的能力和CGS的進步為快速和可擴展的基因組合成奠定了重要的基礎。有了在細胞之間移動大DNA結構的新方法，這些技術使大腸桿菌更接近于成為構建千兆酶級合成基因組學的平臺。
Continuous synthesis of E. coli genome sections and Mb-scale human DNA assembly
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