長(zhǎng)期以來(lái)，檢測(cè)和分析蛋白質(zhì)的能力一直是科學(xué)家們的關(guān)鍵追求。幾十年來(lái)，對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性的追求促進(jìn)了一系列技術(shù)飛躍。從早期的凝膠電泳和 Western blotting 的發(fā)明到自動(dòng)化 Western 分析的發(fā)展，研究人員不斷突破蛋白質(zhì)分析工具的界限。
1807年，科學(xué)家首次觀察到在電場(chǎng)作用下，水中的粘土顆粒向正極移動(dòng)的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象為電泳奠定了基礎(chǔ)。直到20世紀(jì)50年代，隨著淀粉和聚丙烯酰胺等電泳基質(zhì)的引入，研究人員才開(kāi)始使用凝膠電泳技術(shù)從復(fù)雜的混合物中分離蛋白質(zhì)1。然而，這些早期的電泳方法無(wú)法區(qū)分大小相似的蛋白質(zhì)。1970年，在醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究噬菌體T4的分子生物學(xué)家烏爾里希·萊姆利（Ulrich Laemmli）意識(shí)到，一種名為十二烷基硫酸鈉（SDS）的蛋白質(zhì)變性洗滌劑可以幫助根據(jù)分子量將多肽鏈分離出來(lái)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀z中遷移時(shí)會(huì)發(fā)生這種變化。通過(guò)創(chuàng)建一種含有不同濃度SDS和聚丙烯酰胺的不連續(xù)雙層凝膠系統(tǒng)，萊姆利能夠更清楚地觀察到蛋白質(zhì)條帶。這種方法現(xiàn)在被稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），它使他能夠識(shí)別出構(gòu)成噬菌體T4衣殼的先前未知的蛋白質(zhì)2。與此同時(shí)，其他研究人員正在使用凝膠電泳來(lái)分離 DNA 等生物分子。1975 年，愛(ài)丁堡大學(xué)的分子生物學(xué)家埃德溫·索恩（Edwin Southern）通過(guò)從電泳分離的片段中檢測(cè)特定 DNA 序列，將這項(xiàng)技術(shù)向前推進(jìn)了一步。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，他引入了一個(gè)新步驟：印跡。在瓊脂糖凝膠上分離 DNA 片段后，他將它們轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，從而捕獲 DNA3。然后，他使用可以與特定 DNA 序列結(jié)合的放射性 RNA 探針，并通過(guò)放射自顯影法檢測(cè)它們。索恩以自己的名字將這項(xiàng)發(fā)明命名為 Southern blotting。
隨著Southern blotting成為分析DNA樣本的流行工具，它也激發(fā)了研究人員探索其在其他應(yīng)用中的潛力。1977年，斯坦福大學(xué)的生化學(xué)家喬治·斯塔克（George Stark）和他的同事們通過(guò)使用一種名為重氮芐氧甲基（DBM）紙的化學(xué)改性纖維素作為轉(zhuǎn)移RNA分子的介質(zhì)，引入了一種RNA印跡法4。他們將這種創(chuàng)新命名為“Northern blotting”，以反映其與Southern blot的聯(lián)系。在成功之后，斯塔克的團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將印跡法應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析，并于1979年7月發(fā)表了他們的方法。他們對(duì)萊姆利的不連續(xù)凝膠系統(tǒng)進(jìn)行了修改，通過(guò)將聚丙烯酰胺/瓊脂糖凝膠混合物加入細(xì)胞裂解液中來(lái)分離蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移時(shí)，他們使用了DBM紙，并使用放射性蛋白質(zhì)來(lái)探測(cè)靶蛋白。使用該方法，該小組成功地鑒定了感染猴痘病毒的腫瘤抗原5。
與此同時(shí)，世界另一端的兩位生物化學(xué)家，弗里德里希·米歇爾研究所的哈里·托賓 （Harry Towbin） 和弗雷德·哈奇癌癥中心的尼爾·伯內(nèi)特 （Neal Burnette） 正在獨(dú)立開(kāi)發(fā)一種類似的蛋白質(zhì)印跡方法。兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都建立了一種電泳印跡程序來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，其中包括使用電場(chǎng)將蛋白質(zhì)從電泳凝膠驅(qū)動(dòng)到硝酸纖維素膜上。哈里·托賓利用一抗結(jié)合靶蛋白，然后使用放射性或熒光標(biāo)記的二抗檢測(cè)一抗。尼爾·伯內(nèi)特的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法略有不同——他使用了一抗和二抗放射性標(biāo)記蛋白。哈里·托賓在1979年發(fā)表了他的方法，比斯塔克的論文發(fā)表晚了兩個(gè)月，而伯內(nèi)特的手稿是在同一時(shí)期準(zhǔn)備的，但最初被拒絕。1981年，伯內(nèi)特的論文被同一本雜志接受，他將這種方法稱為 Western blotting6.
蛋白質(zhì)印跡很快引起了全世界研究人員的注意。在它誕生后的頭十年里，它成為了檢測(cè)與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的關(guān)鍵診斷工具。一些研究人員將WB應(yīng)用于血液樣本中HIV抗體的識(shí)別7，而另一些人則用它來(lái)檢測(cè)由錯(cuò)誤折疊的朊蛋白引起的克雅氏病8。在此期間，技術(shù)進(jìn)步使 Western 印跡更容易獲得。研究人員引入了新的膜材料，例如聚偏二氟乙烯和尼龍，以改進(jìn)印跡過(guò)程。這些材料耐用、穩(wěn)定，可以更有效地結(jié)合蛋白質(zhì)。檢測(cè)方法也發(fā)生了變化?；瘜W(xué)發(fā)光法（使用與酶聯(lián)次級(jí)抗體反應(yīng)后發(fā)出光的化學(xué)發(fā)光底物）取代放射性方法，成為更受歡迎的用于觀察蛋白質(zhì)條帶的方法。
盡管有這些改進(jìn)，但對(duì)于進(jìn)行 Western blotting實(shí)驗(yàn)的研究人員來(lái)說(shuō)，該技術(shù)也有一定的局限性。Western blot方法的實(shí)驗(yàn)步驟較多，操作較為復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，并且該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，如電泳分離不充分、轉(zhuǎn)印不完全、封閉不足或抗體特異性差等都會(huì)影響最終的結(jié)果。此外，該技術(shù)無(wú)法完成對(duì)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量，對(duì)于低豐度蛋白也很難很難檢測(cè)到清晰準(zhǔn)確的條帶。且傳統(tǒng) Western blot的低通量性難以滿足大規(guī)模篩選、組學(xué)研究等對(duì)多樣本、多蛋白同時(shí)分析的需求。
為了解決傳統(tǒng) Western blot的局限性，2011 年，ProteinSimple 團(tuán)隊(duì)在人類蛋白質(zhì)組組織年度世界大會(huì)上推出了第一臺(tái)基于毛細(xì)管的自動(dòng)化 Simple Western 儀器 Simon™ 系統(tǒng)。相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡來(lái)說(shuō)，Simon™顯著提高了蛋白質(zhì)分析的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。2014 年，ProteinSimple （于2014年被Bio-Techne收購(gòu)）推出了 Wes™ 系統(tǒng)，它可在 3 小時(shí)內(nèi)處理多達(dá) 25 個(gè)樣品，靈敏度是 Simon™的 10 倍。
為了滿足客戶的需求，Bio-Techne在2018年推出了 Jess™ 系統(tǒng)，它具有化學(xué)發(fā)光和熒光雙重檢測(cè)功能，使用戶能夠檢測(cè)樣品中的更多靶標(biāo)。并且 Jess™ 系統(tǒng)還集成了內(nèi)置的總蛋白測(cè)量功能，以便更輕松地進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。此外，Bio-Techne還開(kāi)發(fā)了一種創(chuàng)新的 RePlex™ 檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒模擬了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡中的剝離和重新檢測(cè)步驟，但在同一毛細(xì)管內(nèi)，使研究人員能夠從每個(gè)樣品中提取更多數(shù)據(jù)。Simon™、Wes™ 和 Jess™ 的成功只會(huì)推動(dòng) Bio-Techne進(jìn)行更多創(chuàng)新。
此后，Bio-Techne一直致力于擴(kuò)展 Simple Western 的能力，以更好地支持不同的研究需求。例如，2021年推出的 Abby™ 系統(tǒng)為尋求自動(dòng)化 Western 印跡工作流程的研究人員提供了一種易于訪問(wèn)、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的解決方案。
2024年，Bio-Techne隆重推出 Simple Western 家族的最新成員：Leo™系統(tǒng)。Leo™ 一次運(yùn)行可處理多達(dá) 100 個(gè)樣品，并僅需 3 小時(shí)即可提供結(jié)果，顯著提高了通量，使其成為藥物篩選和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等大規(guī)模研究的理想選擇。其擴(kuò)展的多重檢測(cè)功能允許每個(gè)樣品檢測(cè)多達(dá) 8 個(gè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)，為研究人員提供來(lái)自單個(gè)實(shí)驗(yàn)的更全面的數(shù)據(jù)。這些功能使 Leo™ 成為支持各種研究領(lǐng)域和藥物開(kāi)發(fā)階段的多功能工具。
參考文獻(xiàn)1. Sule, R., Rivera, G. & Gomes, A. V. Western Blotting (immunoblotting): History, Theory, Uses, Protocol and Problems. BioTechniques 75, 99–114 (2023).
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3. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503–517 (1975).
4. Alwine, J. C., Kemp, D. J. & Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5350–5354 (1977).
5. Renart, J., Reiser, J. & Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 3116–3120 (1979).
6. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195–203 (1981).
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